目的:1.以塞来昔布和罗格列酮作为对照,通过体外研究观察黄芪、莪术及黄芪与莪术配伍对MKN-45细胞生长、AKP、LDH及VEGF表达的抑制情况,检测黄芪与莪术配伍后是否具有增效作用,并观察各组药物对MKN-45细胞COX-2、NF-κB、PPARγ表达的影响,探讨中药调控COX-2表达的作用机制。2.仍以塞来昔布和罗格列酮作为对照,采用组织块移植法在BALB/c裸鼠体内建立原位移植人胃癌模型,观测黄芪、莪术及黄芪与莪术配伍对人胃癌细胞在BALB/c裸鼠体内生长、转移的影响,分析黄芪与莪术配伍后是否具有协同增效作用,并检测各组药物对人胃癌细胞COX-2、NF-κB、PPARγ表达的影响,从体内研究进一步验证黄芪与莪术配伍调控通过PPARγ/NF-κB实现对COX-2表达的调控。方法:体外研究:体外培养人胃癌细胞MKN-45,取对数生长期细胞分塞来昔布组、罗格列酮组、黄芪组、莪术组、黄芪与莪术配伍组和空白组,药物浓度分别为100umol/L、20umol/L、10mg/L、5mg/L、10mg/L,分别在作用24h、48h、72h后收集细胞。用MTT法检测对细胞的生长抑制率,用分光光度法检测对细胞内LDH、AKP的影响,用ELISA法检测对VEGF表达的抑制情况。应用RT-PCR法检测各实验组COX-2mRNA、NF-κBmRNA、PPARγmRNA表达的变化,western blot方法检测各组细胞COX-2蛋白表达的变化。体内研究:体外培养人胃癌细胞MKN-45,采用组织块移植法在BALB/c裸鼠体内建立原位移植人胃癌模型,60只裸鼠随机分为6组:塞来昔布组、罗格列酮组、黄芪组、莪术组、黄芪与莪术配伍组和空白组,于造模后第三天开始灌胃给药(0.2ml/10g),其中塞来昔布组:90P g·Ng-1·G-1,罗格列酮组:1.8P g·Ng-1·G-1,黄芪组:6.75g·Ng-1·G-1,莪术组:4.5g·Ng-1·G-1,黄芪、莪术配伍组:11.25 g·Ng-1·G-1,空白组给予同体积生理盐水。分别于给药的第3周和第6周处死裸鼠,用电子天平检测各组荷瘤裸鼠的体重和瘤块的重量,比较各组药物对荷瘤裸鼠体重的影响,计算各组药物对瘤块生长的抑制率,并点算第6周各组实验裸鼠的肝转移病灶的情况,用免疫组化法检测瘤块微血管密度(MVD)的变化,计算各组药物的对瘤块微血管密度(MVD)的抑制率。应用RT-PCR法检测两个时间段各实验组COX-2mRNA、NF-κBmRNA、PPARγmRNA表达的变化,以western blot方法检测各组瘤块COX-2蛋白表达的变化。结果:体外研究:各组药物均能显著抑制细胞生长,并具有时间依赖性,其中以塞来昔布组的抑制作用最强,配伍组作用其次,并明显强于单位中药组。塞来昔布组、罗格列酮组、黄芪组、莪术组、黄芪与莪术配伍组在不同时间的抑制率分别为:24h:11.28%、3.91%、8.27%、8.86%、10.04%;48h:28.07%、15.11%、17.08%、24.57%、26.39%;72h:45.78%、24.9%、28.34%、32.07%、39.68%。各组药物对细胞分化酶的抑制作用起始于48h,至72h时作用最强,以塞来昔布组和配伍组作用最明显。各组药物对VEGF均有显著抑制作用,总体以塞来昔布组和配伍组作用最强,明显优于其余3组(P＜0.05)。各组药物随着作用时间的延长,对COX-2mRNA、NF-κBmRNA的表达均有不同程度的下调作用,以塞来昔布组和配伍组最明显,莪术组与罗格列酮组接近,除莪术外,各组药物均能促进PPARγmRNA的表达,以罗格列酮组和配伍组作用最明显,COX-2蛋白表达的变化与COX-2mRNA基本吻合。体内研究:所有药物中仅黄芪与莪术配伍组在作用6周时的裸鼠体重高于其余各组体重(P＜0.01),其余4组药物组和空白组体重无明显差异。对瘤块生长的影响,作用3周时各组药物均有显著的抑瘤作用,与空白组相比,除罗格列酮组P＜0.05外,其余各组药物均P＜0.01,此时塞来昔布组、罗格列酮组、黄芪组、莪术组、黄芪与莪术配伍组抑瘤率分别为:25.27%、10.45%、13.00%、13.72%、27.44%。作用6周时各组药物与空白组相比均P＜0.01,此时塞来昔布组、罗格列酮组、黄芪组、莪术组、黄芪与莪术配伍组抑瘤率分别为:37.73%、20.45%、33.64%、26.40%、43.12%。对瘤块MVD的抑制作用,作用3周时,与空白组相比,塞来昔布组、莪术组和配伍组P＜0.01,罗格列酮组和黄芪组P＜0.05,此时对MVD的抑制率分别为:41.94%、12.90%、12.90%、25.81%、38.71%。作用6周时各组药物对MVD的抑制作用与空白组相比均P＜0.01,此时对MVD的抑制率分别为:43.75%、18.75%、27.08%、21.88%、50.00%。对肝转移的影响,实验第3周未见明显的肝脏转移灶,第6周时,给药组转移灶均显著少于空白组,配伍组作用最明显,优于其余任意一组,其余几组组间无显著差异。对RT-PCR凝胶电泳产物和蛋白条带进行灰度分析显示,对COX-2表达的影响中,塞来昔布组与配伍组能具有显著抑制作用(与空白组相比P＜0.01),且配伍组作用至6周时显著优于塞来昔布纽(P＜0.05),罗格列酮组作用3周时降低不明显,但至6周时可以显著抑制COX-2(P＜0.01)。对PPARγ表达的影响中,作用3周时罗格列酮组促表达作用显著(P＜0.01),配伍组P＜0.05,作用至6周时,罗格列酮组和配伍组与空白组相比均为P＜0.01和P＜0.01,此时塞来昔布组亦产生促表达作用(P＜0.05)。对NF-κB表达的影响中,作用3周时罗格列酮组和配伍组具有明显抑制作用(P＜0.05),作用至6周时,与空白组相比罗格列酮组和配伍组P＜0.01,塞来昔布组、黄芪组、莪术组均P＜0.05。结论:1.黄芪与莪术配伍后对肿瘤细胞生长的抑制具有增效作用。2.COX-2是益气活血治法的有效作用靶点之一,黄芪与莪术配伍后对COX-2的抑制具有增效作用。3.黄芪与莪术的配伍可能是部分通过PPARγ/NF-κB信号途径实现对COX-2表达的调控。4.黄芪与莪术的配伍能更有效的改善荷瘤机体的生存质量、抑制肿瘤肝转移。
