载脂蛋白E与神经元损伤和轴突再生相关机制研究

背景：在哺乳动物中枢神经系统中，神经元及其轴突担负了在结构上构建神经网络，在功能上生成和传递神经信号的作用。生长锥为神经元轴突末端膨大部分，扮演引导轴突生长，最终与靶点接触并传递神经电信号的角色。CNS神经元死亡后，其余神经元无法分裂复制并代替死亡神经元，但轴突受损后表现出一定的再生能力并可促进受损后神经功能的部分恢复。作为CNS中一种主要的载脂蛋白，CNS遭受损伤后，apoE在修复受损神经元以及促进神经元轴突生长方面起到重要作用。但是，损伤后神经元中apoE的来源并不清楚，人类apoE各亚型对生长锥生长和轴突再生的影响也尚待阐明。目的：本研究旨在关注apoE在神经元损伤和轴突再生中扮演的角色。在神经元方面，明确机械损伤后神经元自身apoE的变化，同时损伤后神经元是否从外界摄入apoE以及受损神经元能否激发胶质细胞合成并分泌apoE的相关机制。在神经元轴突和生长锥方面，明确apoE的mRNA和蛋白在神经元轴突、再生轴突以及生长锥中是否存在，观察apoE各个亚型对轴突再生和生长锥生长的影响并探索其可能的信号通路。以期进一步明确TBI后神经元中apoE参与的病理过程和探寻apoE各亚型影响CNS疾病不同预后的机制和可能的干预策略。方法：1，离体培养野生型/apoE KO鼠皮质原代神经元和胶质细胞，建立神经元机械损伤模型，使用western blot检测损伤后野生型神经元胞体和对应培养基中apoE的水平。制作野生型胶质细胞和apoE KO鼠皮质原代神经元状态培养基，分别与损伤后apoE KO神经元和野生型胶质细胞孵育，使用western blot检测对应细胞和培养基中apoE水平。选择ERK信号通路抑制剂（U0126）加入损伤后apoE KO鼠神经元状态培养基和野生型胶质细胞孵育中，同样使用western blot检测各组胞体中和对应的培养基中apoE水平。2，离体培养野生型/apoE KO鼠皮质神经块，建立改进的神经块轴突机械切断模型并获得纯净的轴突。使用RT-PCR和免疫荧光检测神经元轴突和断后再生轴突中apoE的mRNA和蛋白。将人类重组apoE蛋白2、3、4加至神经块培养基中，鬼丙环肽染色神经块轴突末端生长锥，观察不同apoE亚型对生长锥的影响。使用ERK信号通路抑制剂检测apoE亚型作用生长锥的可能信号路径。此外，将人类重组apoE蛋白2、3、4加至切断轴突后的神经块培养基中，观察不同apoE亚型对轴突再生的影响。结果：1，与未机械损伤的野生型原代皮质神经元比较，损伤后神经元中apoE水平增加约2.5倍，但对应培养基中apoE水平无明显改变。损伤后神经元从胶质细胞状态培养基中摄取apoE数量约为未损伤神经元的4倍。损伤神经元状态培养基能激发胶质细胞合成apoE增加约3倍和分泌apoE增加约2倍，加入ERK信号通路抑制剂U0126后，明显地降低了胶质细胞apoE的合成和分泌。2，在神经元轴突和切断后再生的轴突中，RT-PCR和免疫荧光分别显示apoE的mRNA和蛋白为阳性。在神经块中，加入人类重组apoE蛋白2、3、4后生长锥荧光强度分别为：50.7±19.4，58.5±15.4，23.4±13.5，加入apoE4+U0126后生长锥荧光强度为32.8±13.2，其中加入apoE4的生长锥荧光强度，明显低于加入apoE2、3的生长锥荧光强度，而U0126干预的实验组生长锥荧光强度大于未干预组的生长锥荧光强度。在切断轴突后神经块中，加入人类重组apoE蛋白2、3、4后，再生轴突比例为0.414±0.078，0.347±0.091，0.186±0.080，显示apoE4对断后轴突再生促进作用最弱。结论：1，机械损伤后神经元合成apoE增加，同时损伤的神经元从外界摄取更多外源性apoE，并且通过ERK途径诱导胶质细胞合成和分泌的apoE增加。2，ApoE4能负性影响生长锥生长；阻断ERK信号途径能抑制apoE4对生长锥的负性影响。同时apoE4对切断后轴突再生为负性影响。