人体来源成体内皮前体细胞生物学特性研究--一 人体外周血来源内皮前体细胞生物学特性研究 二 人体骨髓细胞体外诱导培养获取“真正内皮前体细胞”的实验研究

第一部分人体外周血单个核细胞来源内皮前体细胞生物学特性研究背景：成体内皮前体细胞的发现彻底推翻了过去人们对于血管新生概念的认识，同时也在血管新生领域和组织工程领域掀起了以内皮前体细胞为核心的应用研究，很多研究者积极投身于该领域并取得了可喜的研究成果。但是，近年来，关于这种细胞的生物学特点，不同的研究组出现了不同的研究结果。目的：通过贴壁培养外周血单个核细胞，获取外周血中所有贴壁生长细胞，对其表型、生长能力和功能进行测试，阐明成体内皮前体细胞的基本生物学特性。方法：取健康成年人外周血200ml，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，接种于Fibronectin包被的培养皿，用EGM-2培养液诱导培养。观察细胞生长特点，描绘原代细胞生长曲线，电镜观察细胞超微结构，采用间接免疫荧光法鉴定细胞表面抗原KDR，VE-cadherin，E-selectin，Ⅷ因子和CD14。RT-PCR检测培养20天的细胞eNOS基因的表达，对体外培养4天的细胞行体外成血管试验。对培养4天，14天，28天的细胞分别进行Dil-Ac-LDL和印度墨汁的双摄取检测。结果：人体外周血单个核细胞在体外诱导培养过程中无明显增殖能力，原代细胞在生长30天左右逐渐死亡。在诱导培养过程中，绝大多数细胞能够吞噬Dil-Ac-LDL，可以表达内皮表面标志物VE-cadherin，KDR，E-selectin，但同时可以表达单核细胞共同抗原CD14，细胞自始至终未表达Ⅷ因子。细胞在培养过程中能够表达eNOS，但其表达强度弱于成熟内皮细胞，经诱导后电镜检查未见有V-P小体，泡浆内有较多的溶酶体及空泡，细胞表面有类似伪足的绒毛状结构。培养7天左右的细胞未能在体外形成血管样结构。在第4，14，28天进行的Dil-Ac-LDL和墨汁双重摄取实验显示这种细胞能够同时吞噬这两种物质，从而说明这种细胞有类似于单核巨噬细胞的吞噬功能。结论：通过体外诱导培养外周血单个核细胞，可以获得表达部分内皮系表面抗原的细胞，但是该种细胞未能表现出明显的增殖能力，且有典型的单核巨噬细胞吞噬功能，因此能否称其为真正的内皮前体细胞，值得进一步研究。第二部分人体骨髓细胞体外诱导培养获取“真正内皮前体细胞”的实验研究背景：有报道认为人体存在一种“真正的内皮前体细胞”，但是其在外周血的含量非常低。而骨髓细胞中内皮前体细胞含量高于外周血。因此理论上来说，如果存在“真正的内皮前体细胞”，骨髓细胞培养能够更加有力的证明这种细胞的存在。目的：获取骨髓来源的贴壁生长细胞，在EGM-2培养液中进行诱导培养，尝试获取贴壁生长细胞，鉴定细胞表型特点，探讨用贴壁生长法获取“真正内皮前体细胞”的可能性。方法：从接受开胸手术病人的胸骨获取骨髓液，用EGM-2培养液在包被有Fibronectin的培养皿中诱导培养，对所获得的原代贴壁细胞及诱导培养30天的细胞进行Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)和印度墨汁双摄取测试。对体外培养30天的细胞进行表面标志物的流式鉴定及用RT-PCR方法测定内皮一氧化氮合酶(eNOS)的表达情况。结果：原代细胞中出现LDL吞噬阳性细胞，但该种细胞可以同时吞噬墨汁且无明显增殖能力。经过诱导培养30天后，所有的细胞几乎全部表达了典型的间充质干细胞的表面标记物，但未表达内皮细胞的表面标记物，也没有内皮型一氧化氮合酶mRNA的表达。结论：骨髓细胞虽含有LDL吞噬阳性细胞，但该种细胞具有单核巨噬细胞特点，且无明显增殖能力，所以用贴壁生长法并不能获取骨髓中的“真正的内皮前体细胞”，其原因值得进一步研究。