斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白的鉴定及定位研究

斑点叉尾鮰病毒(CCV)是最早被发现的鱼类疱疹病毒。因为通过SignaIP3.0(Bendtsen et al.2004) and SOSUI (Hirokawa et al.1998)计算程序,orf10被预测编码Ⅰ型囊膜蛋白。该囊膜蛋白具有一个潜在的裂解信号序列(amino acids, aa1-24)和一个跨膜区(amino acids, aa101-123),所以使用E. coli表达orf10,表达的产物作为抗原用来制备抗体。。本研究分为两部分：第一部分研究orf10基因编码的囊膜蛋白的功能特性和定位；第二部分是选择orf6基因研究了斑点叉尾鮰病毒PCR-ELISA检测方法以及该基因原核表达产物的免疫原性。主要取得以下结果：1、成功地克隆了CCV的orf10基因。orf10有456bp,通过序列比对,和α疱疹病毒科其他已知的种类没有很大的同源性。通过斑点杂交分析,估计的蛋白分子质量接近35kDa,比理论的分子质量稍大(16kDa)。这个差异有两个原因引起,一是转译后修饰,二是和别的囊膜蛋白产生相互作用。同时,完整粒子和囊膜在斑点杂交中的两条带存在2kDa的差异,这可能是因为二硫键和/或糖基化作用,因为orf10被预测存在两个潜在的N-糖基化位点,分别在Asn64和Asn84。同样在原核表达系统中,orf10基因表达的蛋白也显示了同样分子质量,和预期的大小一致,同样缺少翻译后修饰。2、成功地确定了orf10基因在病毒粒子的位置。基于斑点杂交试验和免疫电子显微实验,基因orf10编码的蛋白被证明是一个囊膜蛋白。3、中和实验的结果表明CCV感染力降低,可能是因为位阻现象或者与抗体结合的封闭作用。这些结果都说明orf10和病毒侵入有直接的关系,虽然准确的机制还不是很清楚。因此,下一步的研究重点应该是抗原表位的研究。4、通过斑点杂交试验表明使用新型表达载体表达的orf6囊膜蛋白具有很好的免疫原性。5、根据CCV的orf6基因设计引物和捕获探针,其中一条引物5‘端标记生物素,而捕获探针的3‘端标记地高辛,利用链亲和素--生物素的亲和作用捕获样品,采用热变性的方法,使用PCR仪完成样品和检测探针的杂交,使用标记碱性磷酸酶的抗地高辛二抗进行显色反应,建立了CCV的PCR-ELISA检测方法。6、建立的PCR-ELISA检测方法具有特异性强,重复性好和敏感度高的特点。重复性检测的批内变异系数小于10%；批间变异系数不大于15%。该方法的敏感度为5龟CCV DNA。