丙二醇脂肪酸单酯(PGME)是良好的油包水型乳化剂,在食品、医药及化妆品领域具有良好的应用前景。脂肪酶经固定化之后,酶的热稳定性、操作稳定性及重复利用性等会得到改善。目前,国内外关于酶法合成不饱和脂肪酸甘油单酯已有深入研究,然而对酶法合成不饱和PGME研究很少,且无溶剂体系下酶法合成的PGME纯度偏低,产物颜色深,不利于制备高质量产品。目前关于采用偏甘油酯脂肪酶合成PGME的研究还未见报道。因此,本文对偏甘油酯脂肪酶SMG1几种突变体进行筛选,研究酯化活力最高的脂肪酶SMG1突变体SMG1-F278N的固定化及该固定化酶的性质,并将其应用于合成丙二醇油酸单酯的研究,以获得高含量和高纯度的丙二醇油酸单酯,为其合成提供理论依据。主要研究结果如下:1.脂肪酶SMG1-F278N的固定化研究。脂肪酶SMG1各突变体中酯化活力最高的是脂肪酶SMG1-F278N,其酯化活力是脂肪酶SMG1野生型的3倍。最佳固定化条件为:固定化载体为环氧树脂ECR8285,缓冲液初始pH=6.0,缓冲液离子强度为1.5M,酶与载体比为20mg/g,固定化时间为2h。在此条件下获得的固定化酶SMG1-F278N的蛋白吸附量为44.62mg/g,酯化活力为466.96U/g,比酶活为10.47U/mg。2.固定化酶SMG1-F278N的酶学性质及其表征。固定化酶SMG1-F278N电镜扫描和红外结果表明,游离酶SMG1-F278N被成功地固定在环氧树脂ECR8285上。固定化酶SMG1-F278N与游离酶相比,其pH和温度适宜范围均变宽;热稳定性增强;固定化酶具有更好的重复利用性,经过7次循环(固定化酶SMG1-F278N催化的第一次酯化反应定义为第一次循环)后,保留其最初活力的98%。3.固定化酶SMG1-F278N催化合成丙二醇油酸单酯的应用研究。相比1,2-丙二醇,固定化酶SMG1-F278N对1,3-丙二醇的选择性优于1,2-丙二醇。采用分子对接辅助分析其原因,结果显示1,3-丙二醇与酶活性中心的Ser171会发生相互作用,同时与Asn278存在氢键相互作用,而1,2-丙二醇与活性中心的Ser171距离较远,不利于其催化反应。最佳合成条件为:1,3-丙二醇与油酸摩尔比为5:1,反应温度为30oC,酶添加量为7.5%,水添加量为7%。在此条件下反应12h后,1,3-丙二醇油酸单酯产量达到70%,纯度达到84.67%。
