两种精子膜蛋白的基因表达研究--1,在真核及原核细胞中的基因表达研究 2,精子发生过程中其基因表达的原位杂交研究
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应用免疫途径控制生育已成为近年来迅速发展的一个领域,将精子膜的关键抗原纯化后作为避孕疫苗的设想是十分诱人的。但是鉴于精子来源困难,分离纯化精子膜蛋白受到了极大的限制。因此应用基因工程的手段,制备精子膜蛋白抗原,进而制备抗生育疫苗已成为必然的趋势。精子膜蛋白的基因工程工作起步较晚,截至1989年底,国外除了美国和加拿大的Herr及Lee开始进行了精子膜的基因研究外,其他尚未见报道。我室在以前工作的基础上用表位筛选法,首次自表达型噬菌体载体λgt11构建的大鼠睾丸cDNA库中筛选出了编码兔精子膜蛋白rSMP-B的cDNA片段(RSD-1)和编码人精子膜蛋白YWK Ⅱ抗原的cDNA片段(RSD-2)。本文采用所分离到的这两个精子膜蛋白cDNA基因片段,借助重组DNA质粒转染中国地鼠卵巢细胞(CHO cell),研究了精子膜蛋白基因在哺乳动物细胞中的表达,并应用原位杂交方法,探讨了这些膜蛋白基因在精子发生过程的表达。 对pSV2dhfr质粒进行改造,切除dhfr基因,加入一个人工合成的寡聚核苷酸片段,构建成哺乳动物细胞表达载体(pSV2-EP)。该载体具有以下结构特点:(1),含SV40早期启动子及DNA复制起点;(2),含有SV40多聚A位点及剪切位点;(3),启动子下游含起始密码子ATG,当外源目的基因来自于表达型载体λgt11 cDNA库,插入载体的EcoRⅠ位点后,由ATG起始可形成开放阅读框架。该载体可作为λgt11库中cDNA片段的通用表达载体。 我们将RSD-1及RSD-2分别插入表达载体pSV2-EP中,然后应用磷酸钙沉淀法分别与带标记基因的pSV2dhfr质粒或pSV2neo质粒共转化CHOdhfr或CHO细胞。经无胸腺嘧啶及次黄嘌呤的培基或含G418(1mg/ml)的培基筛选,得到多个阳性细胞株。对这些细胞株分别以DNA斑点杂交,RNA斑点杂交及间接免疫荧光抗体法检测,发现以RSD-1共转化的细胞株中,有一株在连续传代3个月后,细胞基因组中仍然有RSD-1基因存在,并有mRNA的高效转录及蛋白质的表达。表明RSD-1基因已稳定地整合到细胞基因组中并获得了有效的表达。对RSD-2共转化所得到的细胞株进行检测,同样也得到了阳性结果,在21个细胞株中,有6株为阳性,阳性率约为30%。
中文摘要 | 第4-6页 |
英文摘要 | 第6-8页 |
前言 | 第9-16页 |
实验材料 | 第16-20页 |
实验方法 | 第20-31页 |
实验结果 | 第31-65页 |
讨论 | 第65-70页 |
致谢 | 第70-71页 |
参考文献 | 第71-74页 |
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