CCNL1和TIMP1基因对人乳腺癌细胞增殖及相关基因表达的影响

乳腺癌是常见的危害女性健康的恶性肿瘤之一，其发生、发展是一个多因素、多突变积累的过程，其发病的病因尚未清楚。基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP1）不仅是基质金属蛋白酶的抑制剂，而且还作为一种抗肿瘤的标记物来影响乳腺癌病人的预后效果。很多学者发现TIMP1参与肿瘤细胞的增殖、凋亡及肿瘤的血管发生，且伴随着预后不良。细胞周期蛋白（CCNL1）是最近被确定为一个新的核蛋白质，属于细胞周期蛋白家族。CCNL1包含了C-端精氨酸和丝氨酸丰富（RS）的结构域，在前mRNA剪接中起到重要的作用。在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC），CCNL1原位癌发生中起着关键作用，可作为一个隐匿性晚期肿瘤分期指标。因此，CCNL1被认为头颈部鳞癌候选基因生物标志物。为了研究乳腺癌在发生发展过程中基因表达变化情况，我们随机抽取10个乳腺癌病人的乳腺癌组织和癌旁组织，并通过基因芯片技术对乳腺癌及癌旁组织基因表达进行了差异筛选，通过microarry研究分析，得到303个差异表达基因和112个未知功能基因。对筛选到的33个差异极显著的基因进行了分析及验证。在筛选出的这33个差异表达基因中，我们发现，与细胞增殖有关的CCNL1和TIMP1基因表达明显上调，由此我们推测，CCNL1和TIMP1之间可能会存在某种机制，调控人乳腺癌细胞的增殖，且这两个基因可能存在基因表达上相互影响的关系，为研究这两个基因的功能，我们首先对其进行了原核表达研究，通过RT-PCR技术克隆了CCNL1和TIMP1基因全长，其长度分别为624bp和1581bp，并将CCNL1和TIMP1基因全长连接到原核表达载体pET28a中，成功构建了大肠杆菌表达载体pET28a-TIMP1和pET28a-CCNL1，将鉴定正确的菌种进行表达，并纯化出目的蛋白，经Western blot方法检测到了CCNL1和TIMP1蛋白，其蛋白大小为28.5KD和59.6KD。为今后动物实验奠定了基础。为了进一步研究CCNL1和TIMP1基因对乳腺癌细胞生长的影响及在乳腺癌细胞中CCNL1和TIMP1基因表达之间的关系，我们将能够促进真核基因表达的KOZAK序列分别连接于CCNL1和TIMP1基因的5’端，并将这两个基因分别连接于真核表达载体pcDNA3.1中，成功构建了CCNL1和TIMP1基因全长真核表达质粒（pc-CCNL1-K、pc-CCNL1、pc-TIMP1-K和pc-TIMP1），同时根据CCNL1和TIMP1基因的全长我们构建了RNA干扰质粒，将这个基因的真核表达载体转染至MBA-MD-231和MCF-7细胞中，对MBA-MD-231和MCF-7细胞中CCNL1和TIMP1基因的表达进行检测。结果表明，KOZAK序列能够显著提高CCNL1和TIMP1基因在人乳腺癌细胞（MBA-MD-231和MCF-7）中表达。我们对构建的CCNL1和TIMP1基因的干扰质粒进行了筛选，筛选结果表明，CCNL1RNAi-1173和TIMP1RNAi-229在转录水平上干扰效果最好。为进一步研究CCNL1和TIMP1基因表达之间的相互关系，我们将这两个基因过表达质粒分别转染至MBA-MD-231和MCF-7细胞中，并检测CCNL1和TIMP1基因的表达情况。结果表明CCNL1的过表达能够引起TIMP1基因表达的增加，而TIMP1的过表达也能够引起CCNL1基因表达增加。我们将筛选到的CCNL1和TIMP1基因的干扰质粒分别转染至MBA-MD-231和MCF-7细胞中，对CCNL1和TIMP1基因的表达进行检测，结果表明，CCNL1基因表达的干扰引起TIMP1基因表达显著增加，而TIMP1基因表达的干扰则对CCNL1基因表达的增加影响差异不显著，为进一步研究两基因之间相互影响关系，将TIMP1过表达质粒与CCNL1基因干扰质粒共同转染与乳腺癌细胞中，表现为TIMP1表达的显著增加，TIMP1与CCNL1同时过表达表现为TIMP1和CCNL1表达的强烈增加。由于TIMP1与CCNL1基因对于细胞生长具有调控作用，我们将TIMP1与CCNL1基因的干扰质粒和过表达质粒分别转染至MBA-MD-231和MCF-7细胞中，通过MTT方法检测细胞的生长情况，结果表明，TIMP1对乳腺癌细胞具有正调控作用，CCNL1对乳腺癌细胞具有负调控作用。TIMP1过表达和CCNL1干扰共同作用于乳腺癌细胞时，表现为很强的促进细胞增殖的作用。CCNL1过表达和TIMP1干扰共同作用于乳腺癌细胞时，表现为较明显的抑制细胞增殖的作用。TIMP1和CCNL1过表达共同作用于乳腺癌细胞时，细胞未出现明显的增殖变化。TIMP1和CCNL1干扰共同作用于乳腺癌细胞时，细胞同样未出现明显的增殖变化。说明在乳腺癌细胞中TIMP1和CCNL1同时上调是细胞内维持细胞增殖速度的内部调节机制，以维持细胞平衡的需要。由于癌症的发生是一个多基因、多因素调控产生的。因此，我们推测，在乳腺癌发生时，细胞内TIMP1和CCNL1基因的变化也可能会引起其他基因的变化，因此，我们对TIMP1和CCNL1基因的相关基因变化进行了研究，通过Western blot技术检测了在TIMP1和CCNL1基因过表达时，MMP1、MMP2、CCNL2和P53基因的表达变化情况。结果表明，TIMP1基因的过表达可引起P53和MMP2表达的增加，同时CCNL1的过表达也影响P53和MMP2的表达。TIMP1和CCNL1基因的过表达未对MMP1和CCNL2表达产生显著影响。通过本研究初步探明了在乳腺癌组织和乳腺癌癌旁组织中的基因变化情况，同时，本研究也首次发现了TIMP1与CCNL1基因存在着密切的联系，且CCNL1基因对乳腺癌细胞的生长具有负调控作用，为进一步研究乳腺癌的发生机理奠定了一定的基础。