几种不同鱼内脏脂肪素基因的克隆、表达丰度与基因全序列研究

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内脏脂肪素(visfatin)是近年来发现的一种新型脂肪细胞因子。最初因其可以模拟胰岛素,促进胰岛素受体与胰岛素受体底物磷酸化,而受到广泛关注。随着visfatin与前B细胞集落增强因子(PBEF)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)是同一种物质的提出,visfatin以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成关键限速酶、细胞炎性因子的身份,参与众多生理病理活动的调节,成为维持胚胎正常发育、抵御细胞应激、抑制细胞凋亡等等的重要物质。目前关于visfatin的研究大多集中在人、小鼠等哺乳类模式生物上,而在较低等的脊椎动物——硬骨鱼中,少有报道。本研究旨在探明银鲫、白鲢、草鱼、团头鲂四种硬骨鱼visfatin cDNA和基因全序列,分析visfatin mRNA在不同硬骨鱼不同组织中的表达情况,以丰富硬骨鱼visfatin基因的结构信息,为研究visfatin在硬骨鱼乃至脊椎动物中的分子进化提供依据,为进一步探讨visfatin在硬骨鱼中的作用奠定基础。本研究主要的结果如下:(1)以银鲫肝脏cDNA为模板,克隆得到长约2.0Kb的银鲫visfatin cDNA序列,其中开放读码框架长1482bp,可编码产生由493个氨基酸残基构成的visfatin蛋白;在银鲫visfatin cDNA3’非翻译区(3’-UTR)存在一个典型的多聚腺苷酸加尾信号序列(AATAAA)。银鲫visfatin蛋白含有6个半胱氨酸残基、3个N-糖基化位点和1个酪氨酸硫酸化位点,但缺乏信号肽序列。以银鲫鳍条基因组DNA为模板,通过分段克隆,获取长约10.0Kb的visfatin基因全序列,该序列包括11个外显子和9个内含子。由于在第4外显子与第5外显子之间无内含子插入,但在这两个外显子相接的边缘,存在GT-AG碱基对,符合外显子/内含子剪接规则,故认为银鲫visfatin基因含有11个外显子;银鲫visfatin基因第VI内含子具有两种不同的核苷酸序列,二者仅在最后40bp核苷酸序列有较高同源,这是银鲫visfatin全基因特有的一种现象。在银鲫脑、鳃、心、肝、脾、头肾、肠、肌肉、肠系膜脂肪和卵巢等10种组织中均检测到visfatin表达,其中在鳃、心、肠系膜脂肪、卵巢组织中的含量较高。(2)以白鲢肝脏cDNA为模板,克隆得到长约1.7Kb的visfatin cDNA序列,其中开放读码框架长1482bp,可编码产生由493个氨基酸残基组成的visfatin蛋白。白鲢visfatin蛋白含有6个半胱氨酸残基、2个N-糖基化位点和1个酪氨酸硫酸化位点,也缺乏信号肽序列。以白鲢鳍条基因组DNA为模板,获取长约4.5Kb的visfatin基因序列,该序列包含9个外显子和7个内含子,在第1外显子与第2外显子之间无内含子插入,但在第1、第2外显子相接的边缘,存在GT-AG碱基对,故认为白鲢visfatin基因含有9个外显子。在白鲢脑、鳃、心脏、肝脏、脾脏、头肾、肠、肌肉、肠系膜脂肪和精巢等10种组织中均发现有visfatin表达。(3)以草鱼肝脏cDNA为模板,克隆得到长约1.5Kb的visfatin cDNA序列,其中开放读码框架长1482bp,可编码产生由493个氨基酸残基构成的visfatin蛋白。类似于白鲢,草鱼visfatin蛋白含有6个半胱氨酸残基、2个N-糖基化位点和1个酪氨酸硫酸化位点,同样缺乏信号肽序列。以草鱼鳍条基因组DNA为模板,获得长约3.6Kb的visfatin基因序列,该序列包含10个外显子和7个内含子,虽然在第1外显子与第2外显子、第3外显子与第4外显子之间无内含子插入,但在第1与第2、第3与第4外显子边缘存在GT-AG碱基对,故认为草鱼visfatin基因含有10个外显子。检测visfatin在草鱼脑、鳃、心脏、肝脏、脾脏、头肾、肠、肌肉和肠系膜脂肪等组织中的表达情况,发现9种组织均有visfatin mRNA分布。(4)以团头鲂肝脏cDNA为模板,克隆得到长约1.5Kb的visfatin cDNA序列,其中开放读码框架长1482bp,可编码产生由493个氨基酸残基组成的visfatin蛋白。类似于银鲫,团头鲂visfatin蛋白含有7个半胱氨酸残基、3个N-糖基化位点和1个酪氨酸硫酸化位点,缺乏信号肽序列。以团头鲂鳍条基因组DNA为模板,获得长约3.0Kb的visfatin基因序列,该序列包含9个外显子和6个内含子,同草鱼,在第1外显子与第2外显子、第3外显子与第4外显子虽无内含子插入,但在第1与第2、第3与第4外显子边缘存在GT-AG碱基对,因此认为团头鲂visfatin基因含有9个外显子。在团头鲂脑、鳃、心脏、肝脏、脾脏、头肾、肠、肌肉、肠系膜脂肪和精巢等10种组织中均发现有visfatin mRNA的存在。结论:在银鲫、白鲢、草鱼和团头鲂四种硬骨鱼中,visfatin基因编码序列保守性良好,对应的氨基酸序列也表现出高度同源,但是非编码区差异较大,主要体现在内含子的个数、相应内含子的长度以及某些内含子序列的同源性上,四种硬骨鱼内含子个数不尽相同,所含碱基数也多少有异,某些内含子在四种硬骨鱼之间基本没有同源性可言。Visfatin在四种硬骨鱼不同组织中都有表达,提示visfatin可能在硬骨鱼中广泛分布,并且起着基础的调节作用。
摘要第8-10页
Abstract第10-12页
缩略词表第13-14页
第一章 文献综述第14-34页
    1.1 Visfatin的结构第15-18页
        1.1.1 Visfatin基因的分子特征第15-16页
        1.1.2 Visfatin蛋白的基本结构第16-18页
    1.2 Visfatin的分布第18-19页
    1.3 Visfatin的表达调控第19-22页
        1.3.1 细胞因子对visfatin表达的调节第19-20页
        1.3.2 激素对visfatin表达的调节第20页
        1.3.3 药物对visfatin表达的调节第20-21页
        1.3.4 其他因素对visfatin表达的调节第21-22页
    1.4 Visfatin的生理学功能第22-30页
        1.4.1 Visfatin的类胰岛素作用第22-23页
        1.4.2 Visfatin的Nampt酶活性第23-27页
        1.4.3 Visfatin的细胞因子特性第27-30页
    1.5 Visfatin与疾病第30-33页
        1.5.1 Visfatin与代谢综合征第30-31页
        1.5.2 Visfatin与动脉粥样硬化第31-32页
        1.5.3 Visfatin与恶性肿瘤第32-33页
    1.6 实验动物简介第33-34页
第二章 研究的目的与意义第34-35页
第三章 材料与方法第35-48页
    3.1 实验材料第35-38页
        3.1.1 实验动物第35页
        3.1.2 试剂盒第35-36页
        3.1.3 工具酶第36页
        3.1.4 其他试剂第36页
        3.1.5 培养基及宿主菌第36页
        3.1.6 主要溶液的配制第36-37页
        3.1.7 主要仪器设备第37-38页
        3.1.8 主要引物第38页
    3.2 实验方法第38-48页
        3.2.1 样品采集第38页
        3.2.2 总RNA提取第38-40页
        3.2.3 逆转录合成cDNA第一链第40-41页
        3.2.4 PCR扩增visfatin DNA片段第41-42页
        3.2.5 目的片段的回收、连接、转化与鉴定第42-44页
            3.2.5.1 目的片段的回收第42页
            3.2.5.2 目的片段与pMD-18T载体连接第42页
            3.2.5.3 DH5α感受态细胞的制备第42页
            3.2.5.4 连接产物转化DH5α感受态细胞第42-43页
            3.2.5.5 转化子的鉴定第43页
            3.2.5.6 质粒DNA提取第43-44页
        3.2.6 3’-RACE快速扩增银鲫visfatin cDNA 3’末端第44页
        3.2.7 半定量PCR检测visfatin在不同组织中的表达第44-45页
        3.2.8 荧光定量PCR检测银鲫visfatin在不同组织中的表达第45页
        3.2.9 visfatin基因全序列分析第45-46页
            3.2.9.1 基因组DNA的提取第45-46页
            3.2.9.2 Visfatin非编码序列的PCR扩增第46页
            3.2.9.3 非编码序列的回收、连接、转化与鉴定第46页
            3.2.9.4 Visfatin基因全序列的拼接第46页
        3.2.10 数据分析第46-48页
第四章 结果与分析第48-77页
    4.1 不同组织总RNA提取与检测第48页
    4.2 18S内参PCR扩增检测不同组织cDNA质量第48-49页
    4.3 银鲫visfatin cDNA序列、基因全序列及组织表达第49-56页
        4.3.1 银鲫visfatin cDNA序列PCR扩增第49页
        4.3.2 银鲫visfatin cDNA序列及visfatin蛋白预测第49-52页
        4.3.3 银鲫visfatin编码序列及氨基酸序列同源性分析第52-55页
        4.3.4 半定量PCR测定银鲫visfatin在不同组织中的表达第55页
        4.3.5 荧光定量PCR测定银鲫visfatin在不同组织中的表达第55页
        4.3.6 银鲫visfatin基因全序列第55-56页
    4.4 白鲢visfatin cDNA序列、基因序列及组织表达第56-63页
        4.4.1 白鲢visfatin基因cDNA序列第56-60页
        4.4.2 半定量PCR测定白鲢visfatin基因在不同组织中的表达第60-62页
        4.4.3 白鲢visfatin基因序列第62-63页
    4.5 草鱼visfatin cDNA序列、基因序列及组织表达第63-66页
        4.5.1 草鱼visfatin基因cDNA序列第63-65页
        4.5.2 半定量PCR测定草鱼visfatin基因在不同组织中的表达第65页
        4.5.3 草鱼visfatin基因序列第65-66页
    4.6 团头鲂visfatin cDNA序列、基因序列及组织表达第66-69页
        4.6.1 团头鲂visfatin基因cDNA序列第66-68页
        4.6.2 半定量PCR测定团头鲂visfatin基因在不同组织中的表达第68-69页
        4.6.3 团头鲂visfatin基因序列第69页
    4.7 银鲫、白鲢、草鱼和团头鲂visfatin基因序列与蛋白序列比对第69-77页
        4.7.1 银鲫、白鲢、草鱼和团头鲂visfatin cDNA序列比对第69-74页
        4.7.2 银鲫、白鲢、草鱼和团头鲂visfatin内含子序列对比第74页
        4.7.3 银鲫、白鲢、草鱼和团头鲂visfatin氨基酸序列比对第74-75页
        4.7.4 银鲫、白鲢、草鱼和团头鲂visfatin蛋白系统进化分析第75-77页
第五章 讨论第77-81页
    5.1 保守氨基酸对四种硬骨鱼visfatin蛋白空间结构的影响第77-78页
    5.2 Visfatin在不同物种间高度保守第78页
    5.3 四种硬骨鱼visfatin基因内含子序列高度变异第78-79页
    5.4 Visfatin在四种硬骨鱼体内呈广谱表达第79页
    5.5 四种硬骨鱼visfatin基因无可变剪接第79-81页
第六章 结语第81-83页
    6.1 结论第81-82页
    6.2 本研究的创新之处第82页
    6.3 本研究的不足之处第82-83页
参考文献第83-94页
附录第94-102页
研究生期间发表论文第102-103页
致谢第103页
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