背景及目的：慢性胰腺炎是胰腺癌发生的高危因素,慢性炎症组织微环境改变可以诱导基因表观遗传学改变。我们前期研究发现SIRT1可以促进胰腺癌的发生,但是对其调控机制尚未深入研究。本研究旨在探讨HIC1基因启动子甲基化及HIC1/SIRT1表达在慢性胰腺炎及胰腺癌发生中的作用。研究方法：应用甲基化特异性PCR检测正常胰腺组织、慢性胰腺炎组织及胰腺癌组织中HIC1启动子CpG岛的甲基化水平,比较HIC1甲基化与胰腺癌临床病理学特征之间的关系；用免疫组织化学染色及实时荧光定量PCR法检测临床标本中HIC1蛋白及SIRT1蛋白的表达,比较HIC1和SIRT1表达的相关性。检测胰腺癌细胞系PANC-1、BXPC-3、ASPC-1中HIC1基因启动子甲基化水平。通过去甲基化试剂5-aza-dC处理胰腺癌细胞系,诱导HIC1基因启动子去甲基化。利用western blot检测5-aza-dC处理后胰腺癌细胞系中HIC1及SIRT1蛋白表达情况,同时用MTT法绘制细胞生长曲线,β半乳糖苷酶染色检测细胞衰老状态,流式细胞学技术检测细胞周期的及细胞凋亡的改变。在PANC-1细胞系中转染pCDNA3FlagHIC1真核表达质粒,通过G418筛选构建HIC1高表达的PANC-1细胞。应用vvestern blot检测HIC1蛋白高表达对SIRT1表达的影响,以及对细胞增殖、周期、凋亡及衰老的作用。此外,在HIC1稳定转染的PANC-1细胞中,通过瞬时转染pCDNA3F1agSIRT1再次上调SIRT1的表达,观察对细胞增殖、周期、凋亡及衰老的调控作用。为了初步探讨HIC1/SIRT1对细胞生物学的影响的分子机制,在5-aza-dC处理的PANC-1、BXPC-3, ASPC-1细胞中和利用外源性基因表达调控HIC1/SIRT1通路的PANC-1细胞中,用western blot法检测乙酰化P53、总P53、p21WAF1/CIP1蛋白的表达情况。研究结果：HIC1启动子甲基化阳性率在正常胰腺组织、慢性胰腺炎组织及胰腺癌组织中分别为11.4%、47.5%、79.3%,统计学显示HIC1启动子甲基化水平在慢性胰腺炎和胰腺癌组织中逐渐增加(P<0.01)。HIC1启动子甲基化水平与患者的年龄、肿瘤TNM分期相关(P<0.01),与肿瘤直径、肿瘤组织分化程度无关(P>0.05)。免疫组织化学染色显示HIC1在正常胰腺、慢性胰腺炎及胰腺癌中表达阳性率分别为91.4%,62.5%,37.5%,统计学显示HIC1蛋白表达在慢性胰腺炎和胰腺癌组织中逐渐下降(P<0.01)。SIRT1在正常胰腺、慢性胰腺炎及胰腺癌中表达分别为48.6%,80%,92.2%,统计学显示SIRT1在慢性胰腺炎及胰腺癌中表达明显高于正常胰腺组织(P<0.001)。在HIC1甲基化阳性的胰腺组织样本中,HIC1蛋白表达阳性率明显低于HIC1甲基化阴性组(P<0.001)。HIC1蛋白表达与患者的年龄、肿瘤TNM分期相关(P<0.01),与肿瘤直径、肿瘤组织分化程度无关(P>0.05)。实时荧光定量PCR证实胰腺组织样本中HIC1和SIRT1 mRNA表达水平和蛋白表达水平一致。胰腺癌细胞系PANC-1、BXPC-3以及ASPC-1中均存在HIC1启动子甲基化和HIC1蛋白表达缺失。5-aza-dC干预可逆转胰腺癌细胞中HIC1的甲基化状态,恢复HIC1蛋白表达的同时下调SIRT1的蛋白表达。MTT检测发现5-aza-dC处理后细胞增殖明显减缓。流式细胞学检测发现5-aza-dC处理胰腺癌细胞系后三株细胞均出现明显的G1期阻滞,并可以诱导PANC-1细胞凋亡。β半乳糖苷酶染色检测发现5-aza-dC干预后在3株胰腺癌细胞中均出现衰老比例增加。真核表达质粒pCDNA3F1agHIC1转染PANC-1细胞后,通过G418筛选获得HIC1稳定表达细胞。western blot检测发现在该细胞中SIRT1表达明显下降。MTT检测发现转染稳转HIC1的PANC-1细胞相对野生型PANC-1细胞增殖速度明显减慢,β半乳糖苷酶染色检测发现衰老细胞比例明显增加(16.3±3.1%vs 56.6±5.5%)。流式细胞学检测发现转染后细胞出现G1期停滞(55.3±2.5%vs 70.6±2.3%),凋亡比例增加(2.7±0.5%vs 13.4±1.1%)。在稳转HIC1的PANC-1细胞中转染pCDNA3F1agSIRT1可以再次上调SIRT1的表达,促进细胞增殖、抑制细胞的衰老、缓解G1期阻滞,但对细胞凋亡无明显影响。5-aza-dC干预三株胰腺癌细胞可以诱导p21WAF1/CIP1表达上调,但对总P53和乙酰化P53蛋白表达无明显影响；稳转HIC1的PANC-1细胞相对于野生型PANC-1细胞乙酰化P53比例增加,p21WAF1/CIP1表达上调。再次转染pCDNA3F1agSIRT1后可以部分逆转其表达。结论：1.HIC1启动子甲基化水平在慢性胰腺炎组织和胰腺癌组织中逐渐增加,与患者年龄、肿瘤TNM分期密切相关。HIC1甲基化水平和HIC1蛋白表达呈负相关。HIC1和SIRT1胰腺组织中呈排他性表达趋势,说明胰腺癌组织中HIC1甲基化有可能通过沉默HIC1蛋白表达导致SIRT1表达上调,为体外研究HIC1/SIRT1通路奠定了基础。2.通过去甲基化试剂5-aza-dC可以逆转胰腺癌细胞中HIC1甲基化,下调SIRT1的表达,并能显著抑制细胞增殖,诱导细胞衰老和G1期阻滞。说明对HIC1表观遗传学的调控可以发挥抑制胰腺癌生长的作用。3.成功构建HIC1稳转PANC-1细胞系,靶向上调HIC1表达可以抑制SIRT1表达,抑制细胞增殖,诱导细胞衰老和G1期阻滞。再次上调SIRT1可部分逆转HIC1上调所带来的生物学效应。证实在胰腺癌细胞中HIC1通过SIRT1发挥生物学作用。4.5-aza-dC逆转HIC1甲基化和外源性基因调控HIC1/SIRT1表达可以影响乙酰化P53的比例和p21WAF1/CIP1蛋白的表达,说明乙酰化P53和P21是HIC1/SIRT1信号通路下游的重要靶蛋白。
