目的：应用结核分枝杆菌散在重复单位(MIRU)分型技术和鉴定北京基因型的方法来研究甘肃临夏回族自治州结核分枝杆菌的分子流行病学特征,寻找优势菌株,并评估该方法在结核病分子流行病学方面的应用价值。方法：甘肃省疾病预防控制中心负责监测并收集甘肃省临夏回族自治州2004-2006两年间结核分枝杆菌和相关病例资料,共收集菌株318株。对其中培养成功并且鉴定为结核分枝杆菌(分别采用对硝基苯甲酸生长试验和噻吩-2-羧酸肼培养基试验,PNB和TCH)的218株(69%)菌株进行基因分型。采用绝对浓度法,将218个痰涂片阳性的标本在罗氏(L-J)培养基上进行抗结核药物敏感性实验。采用氯仿、异戊醇手工提取分枝杆菌DNA,12个MIRU位点的等位基因位置、重复序列大小以及扩增引物的设计合成,参考有关文献进行。使用凝胶图像分析系统对电泳结果进行分析,12个MIRU位点的拷贝数按顺序组成一个12位数字,称为该标本的MIRU基因型,根据基因型是否相同,判断菌株是成簇还是独特型；采用UPGMA法对结核分枝杆菌基因型数字化的结果进行聚类分析；用Microsoft Excel软件处理和分析数据,计算12个MIRU等位基因的多态性和MIRU等位基因的分辨率指数(HGDI);结合流行病学资料,分析菌株的流行和传播特征。鉴定北京株是通过对RD105缺失区的检测,使用P1,P2、P3引物参考有关文献进行设计合成。使用D2000 Marker作分子量标志,同时以H37Rv标准株和无菌蒸馏水以相同引物进行PCR扩增产物分别作阳性和阴性对照。使用凝胶图像分析系统对电泳结果进行分析,目的条带在761bp处为北京株,目的条带在1600bp处为非北京株。结果：218株结核分枝杆菌分离自不同的病人,其中男性144人(66%),女性74人(34%),平均年龄45.4岁(范围14-79岁)。有54(24.77%)株菌株至少对一种药物耐药,其中31(14.22%)株菌株是耐多药菌株,至少对利福平和异烟肼同时耐药,剩余菌株是敏感菌株。218株结核分枝杆菌共分为115种不同的MIRU基因型,包括98种独特型和17个簇集群包含120株(55.05%)成簇菌株,成簇率为47.25%,簇的范围为2-58,最大簇的基因型为223325173533,包含58株菌株；通过对缺失区RD105的检测,188株(86.23%)为北京基因型,30株(13.77%)为非北京基因型；结合MIRU基因分型和北京基因型分型两种分型方法共分为118种不同基因型,包括101种独特性和17个簇集群包含117株(54.13%)。MIRU基因分型中58株最大簇集群中50株菌株为北京基因型,8株为非北京基因型。12个MIRU位点在218株菌株中、在北京株和非北京株中的多态性有较大差别；MIRU等位基因的分辨率指数数(HGDI)为0.93,MIRU基因分型和北京基因型分型两种方法结合分型分辨率指数为0.94.结论：北京基因型的鉴别在流行病学分析中比较重要,将MIRU基因分型和北京基因型鉴定方法结合,发现甘肃临夏州的主要流行菌株是MIRU基因型为223325173533的菌株,且主要流行菌株中大部分为北京家族菌株。此两种分型方法结合分型是简单、快速、有效、低成本的分型方法,比较适合用于我国结核分枝杆菌基因分型。目的：从就诊于甘肃省兰州市肺科医院的痰标本中筛查结核分枝杆菌利福平依赖菌株,初步研究利福平依赖菌株表型和基因型的变异,研究其致病机制,为依赖利福平菌株引起的结核病的诊断和防治提供新思路。方法：将甘肃省兰州市肺科医院检验科筛查的6例结核分枝杆菌利福平依赖株,接种于含与不含利福平的罗氏培养基进行传代培养,观察培养基中菌落生长情况,采用萋尔-纳尔逊(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法对罗氏培养基有菌落生长的标本进行涂片、染色、显微镜下观察细菌的形态；提取其中依赖现象明显的4株菌株DNA, MIRU12位点PCR扩增以及鉴定是否为北京家族菌株,进行菌株基因分型,以及测定依赖现象最明显菌株1034全基因组DNA、转录组RNA序列。结果：6例结核分枝杆菌利福平依赖菌株中,4例利福平依赖现象明显,罗氏培养结果观察显示罗氏培养基中利福平依赖菌株对利福平的依赖现象比较明显,在不含有利福平的培养基中菌落细小、较少,在含有利福平的培养基中菌落粗大、多,菌株1034传代培养16代后,依赖现象仍然明显存在；但是抗酸染色结果显示前几代细菌在不含有利福平的培养基中的菌体细小,在含有利福平的培养基中菌体粗大,传代培养至6-7代,在含有利福平和不含有利福平培养基中的细菌抗酸染色结果没有区别,基本一致。通过MIRU基因分型,4株利福平依赖菌株中,其中3株基因型为223325173533,与我们之前寻找出的甘肃省优势菌株基因型一致,另外1株基因型为222325173533；通过DTM-PCR方法鉴定此4株依赖菌株均属于北京家族菌株。我们已经提取利福平依赖菌株1034 DNA及RNA(对照组、利福平高浓度组),送往华大基因公司做全基因组及转录组的测序,结果尚未报告。结论：临床结核分枝杆菌的利福平依赖现象存在,但不稳定；利福平依赖现象可能是由于体内外环境不同从而导致在体外培养过程表型的变异,出现依赖现象,也可能是基因的变异而致依赖现象的发生；及时监测临床利福平依赖菌株对结核病的治疗有指导意义；通过对临床利福平依赖菌株表型、基因变异的研究,了解依赖菌株的致病机制。
