重组华溪蟹金属硫蛋白在SUMO融合系统中的表达与纯化及金属螯合能力的研究

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金属硫蛋白(Metallothionein, MT)是一类富含半胱氨酸、低分子量(2~7kDa)、无芳香族氨基酸和组氨酸、能与金属结合的非常独特的蛋白质,它在生物界中广泛分布。近年来的研究表明,MT参与体内微量元素的储存、转运和代谢,拈抗电离辐射、清除自由基以及对重金属的解毒作用。甲壳类动物的MT发现相对较晚。研究表明,MT可以通过其大量的Cys残基螯合重金属并清除活性氧,使动物体免受氧化损伤,参与动物的发育、抵抗逆境胁迫等多种生理过程,是一种重要的功能蛋白。本课题组在前期承担的国家自然科学基金(No.30640051)中,系统地研究了华溪蟹主要组织MT表达情况以及与重金属蓄积的关系,并完成了镉诱导河南华溪蟹(Sinopotamon henanense) MT cDNA全长序列的克隆。在此基础上,本研究采用PCR扩增技术,将克隆得到的MT基因两端加上酶切位点,然后使用基因重组技术将获得的MT基因分别克隆至pET28a、 pET28a-SUMO和pGEX-6p-1三个表达载体上,构成重组表达载体,测序公司的测序结果证明三种重组表达载体均构建成功。将三种重组表达载体分别转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株,诱导表达目的蛋白,收集菌体超声波破壁后的上清液,经SDS-PAGE分析表明,IPTG成功诱导了MT蛋白的表达,并且根据SDS-PAGE电泳结果比较分析三种重组质粒中MT的表达量,最终确定MT在SUMO融合表达系统中可溶性表达量更高。通过研究诱导温度、诱导时间和诱导浓度三个条件对MT融合蛋白表达量的影响,优化了SUMO原核表达系统的诱导表达条件,最终确定在37℃条件下使用1mmolIPTG诱导6小时,MT融合蛋白的可溶性表达量最高。用SUMO表达系统获得的MT融合蛋白携带有his标签,使用Ni亲和层析法纯化MT融合蛋白,经咪哗缓冲液洗脱后,收集纯化蛋白,经SDS-PAGE电泳分析表明蛋白纯化效果较好,去除大部分的杂蛋白,获得了较纯的MT融合蛋白。本论文采用定点突变技术,对MT的一级结构经行了部分改造,构建了两种突变体SUMO-MTt1和SUMO-MTt2,诱导表达SUMO-MTt1SUMO-MTt2, SUMO-MT和GST-MT四种融合蛋白,在诱导的过程中分别加入终浓度为300μMn的Cu、Cd、Zn三种重金属离子,诱导完成后用火焰原子及收光谱法,测定了表达菌体中重组MT对Cu、Cd、 Zn种金属的吸附能力。结果表明,与空菌体比较,4种MT融合蛋白对Cu、Cd、Zn三种金属离子具有很明显的结合能力,但是每一种MT融合蛋白对不同的金属离子的结合能力是有差异的。总体来看,四种MT融合蛋白对Cd的吸收量最大,而对Zn和Cu的吸收能力相近。比较四种蛋白对同种金属离子的吸收量可以看出,经过一级结构改造的突变体比未突变的蛋白结合能力更强,尤其是在对Cd2+的吸收能力上,SUMO-MTt1比未改造的SUMO-MT有明显的提高,这可能与Cys的数量、位置以及中间连接区的长短有关。
目录第4-8页
CONTENTS第8-12页
中文摘要第12-13页
ABSTRACT第13-14页
第一章 综述第15-23页
    1 MT的特性及研究进展第15-20页
        1.1 金属硫蛋白的理化性质及结构特点第15-16页
        1.2 金属硫蛋白的生理功能第16-17页
        1.3 MT的分类第17-18页
        1.4 MT的分离纯化研究现状及进展第18页
        1.5 MT的突变体研究第18-19页
        1.6 MT的应用前景第19-20页
    2 MT原核表达系统的研究进展第20-22页
        2.1 原核表达系统简介第20-21页
        2.2 MT的原核表达研究进展第21页
        2.3 SUMO融合表达系统简介第21-22页
    3 本论文的研究内容和目的意义第22-23页
第二章 重组华溪蟹金属硫蛋白原核表达载体的构建第23-37页
    摘要第23页
    1 材料与方法第23-30页
        1.1 材料第23-25页
            1.1.1 实验材料第23页
            1.1.2 主要实验试剂第23-24页
            1.1.3 实验仪器第24-25页
        1.2 实验方法第25-30页
            1.2.1 原核表达载体pET28a-MT和pET28a-SUOM-MT的构建第25-29页
                1.2.1.1 PCR加酶切位点第26-27页
                1.2.1.2 PCR产物的检测及胶回收目的片段第27页
                1.2.1.3 目的片段的克隆第27页
                1.2.1.4 目的片段与表达载体pET28a-SUMO、pET28a的双酶切第27-28页
                1.2.1.5 目的片段与农达载体的连接第28页
                1.2.1.6 连接产物的转化第28-29页
                1.2.1.7 质粒的提取第29页
                1.2.1.8 重组表达载体的筛选和PCR鉴定及测序第29页
                1.2.1.9 菌种的保存第29页
            1.2.2 原核表达载体pGEX-6p-1-MT的构建第29-30页
    2 实验结果第30-33页
        2.1 原核表达载体pET28a-MT和pET28a-SUOM-MT的构建第30-32页
            2.1.1 PCR扩增目的基因MT第30-31页
            2.1.2 目的片段与T载体连接第31页
            2.1.3 T-MT与表达载体pET28a和pET28a-SUOM的双酶切第31-32页
            2.1.4 重组表达载体pET28a-MT和pET28a-SUOM-MT的鉴定第32页
        2.2 原核表达载体pGEX-6p-1-MT的构建第32-33页
    3 讨论第33-34页
    4 本章小结第34-35页
    Abstract第35-37页
第三章 重组华溪蟹金属硫蛋白在大肠杆菌中的融合表达及其重金属螯合能力的研究第37-58页
    摘要第37页
    1 材料与方法第37-47页
        1.1 材料第37-40页
            1.1.1 实验材料第37-38页
            1.1.2 实验试剂第38-40页
            1.1.3 实验仪器第40页
        1.2 实验方法与步骤第40-47页
            1.2.1 原核表达载体pET28a-MT和pET28a-SUOM-MT中MT的表达第40-42页
                1.2.1.1 农达载体质粒的转化第40-41页
                1.2.1.2 MT基因的诱导表达第41页
                1.2.1.3 SDS-PAGE检测MT的表达第41-42页
            1.2.2 原核表达载体pGEX-6p-1-MT中MT的表达第42页
            1.2.3 原核表达载体pET28a-SUOM-MT中MT的诱导表达条件的优化第42页
                1.2.3.1 诱导温度的优化第42页
                1.2.3.2 IPTG浓度的优化第42页
                1.2.3.3 诱导时间的优化第42页
            1.2.4 SUMO系统表达的MT融合蛋白的大量表达、纯化及鉴定第42-45页
                1.2.4.1 MT融合蛋白的大量表达第42页
                1.2.4.2 MT融合蛋白的纯化第42-43页
                1.2.4.3 MT融合蛋白的Western Blot分析第43-44页
                1.2.4.4 MT融合蛋白的浓度测定第44-45页
            1.2.5 金属硫蛋白的重金属螯合能力的研究第45-47页
                1.2.5.1 金属硫蛋白一级结构的改造第45-46页
                1.2.5.2 不同MT融合蛋白重金属螯合能力的比较第46-47页
    2 实验结果第47-54页
        2.1 原核表达载体pET28a-MT和pET28a-SUOM-MT中MT的表达第47页
        2.2 原核表达载体pGEX-6p-1-MT中MT的表达第47-48页
        2.3 原核表达载体pET28a-SUOM-MT中MT的诱导表达条件的优化第48-50页
            2.3.1 温度对MT表达量的影响第48-49页
            2.3.2 IPTG浓度对MT表达量的影响第49页
            2.3.3 诱导时间对MT表达量的影响第49-50页
        2.4 SUMO系统表达的MT融合蛋白的纯化和浓度的测定第50-52页
            2.4.1 MT融合蛋白的纯化第50-51页
            2.4.2 MT融合蛋白的浓度测定第51-52页
            2.4.3 MT融合蛋白的Western Blot分析第52页
        2.5 金属硫蛋白的重金属螯合能力的研究第52-54页
            2.5.1 金属硫蛋白一级结构的改造第52-53页
            2.5.2 不同MT融合蛋白重金属螯合能力的比较第53-54页
    3 讨论第54-56页
        3.1 金属硫蛋白在SUMO系统与GST系统表达的差异第54-55页
        3.2 MT的大量表达及表达条件的优化第55页
        3.3 SUMO系统表达的MT融合蛋白的纯化第55页
        3.4 MT融合蛋白的Western Blot分析第55-56页
        3.5 火焰原子光谱吸收法测定MT的金属螯合能力及分析第56页
    4 本章小结第56-57页
    Abstract第57-58页
参考文献第58-64页
攻读硕士研究生期间成果第64-65页
致谢第65-66页
作者简介第66-68页
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