研究目的：研究TGF-β1对乳腺癌细胞中乳腺癌干细胞标记物表达、对乳腺癌干细胞富集、自我更新、转移侵袭、化疗耐药等相关基因蛋白表达的影响及对乳腺癌细胞周期、侵袭及诱导耐药等方面的作用；盐霉素对乳腺癌干细胞的作用及其逆转表阿霉素及多西紫杉醇耐药的作用。研究方法：取用MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-231、SKBR3四株乳腺癌细胞株,运用流式细胞仪法检测各株细胞中ALDH1阳性细胞群比例及细胞周期,实时定量逆转录PCR(Q-RT-PCR), Western blot法检测p21的表达；同法比较TGF-β1作用四株细胞后ALDH1阳性细胞群、细胞周期、p21基因及蛋白水平表达差异；乳腺细胞球培养法富集乳腺癌干细胞,流式细胞仪检测TGF-β1在富集乳腺癌干细胞中的作用,Q-RT-PCR、Western blot法检测各处理因素的乳腺癌细胞侵袭转移、化疗耐药、周期调控、细胞转化相关因子SATB1、MMP1、P21、Vimentin、E-cadherin基因及蛋白水平表达差异；Transwell侵袭小室法检测各处理因素前后乳腺癌细胞侵袭能力变化；CCK-8法检测各处理因素前后乳腺癌细胞对化疗药物表阿霉素、多西紫杉醇、盐霉素药物敏感性差异；将盐霉素与表阿霉素、多西紫杉醇两药或三药联合作用各处理因素乳腺癌细胞,CCK-8法检测细胞生长抑制率,检测盐霉素在逆转表阿霉素及多西紫杉醇耐药方面的作用。实验结果：流式细胞仪检测显示MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-23、SKBR3四株细胞中ALDH1阳性细胞群比例分别为1.49%、8.38%、1.53%、4.23%,以MCF7/ADM细胞株中ALDH1阳性细胞群含量最高。加入TGF-β1培养后MCF7、MCF7/ADM、SKBR3三株细胞株(ALDH1不宜做为MDA-MB-231乳腺癌干细胞标记物)中ALDH1阳性乳腺癌干细胞侧群比例平均分别为3.83%、10.06%、6.32%。加入TGF-β1培养后MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-231、SKBR3四株细胞中p21 mRNA的表达分别较未加入TGF-β1培养细胞显著上调,分别上调2倍、1.7倍、1.5倍和1.2倍(n=3,p<0.05)。加入TGF-β1培养后MCF7、MCF7/ADM、MDA-MB-231、SKBR3四株细胞表现出G1期阻滞(n=3,p<0.05)。TGF-β1上调p21、SATB1、MMP1、Vimentin的表达,下调E-cadherin的表达；TGF-β1使细胞出现进一步的G0/G1期阻阻滞(p<0.001)。TGF-β1可使细胞具有更强的克隆形成能力,细胞球形成率显著升高(p<0.001)；TGF-β1可增强细胞侵袭能力(p<0.05)。表阿霉素(EPI)、多西紫杉(DOX)对MCF7的IC50值分别为：0.4ug/ml、0.2ug/ml;对MCF7/ADM的IC50值分别为：20ug/ml、0.6ug/ml;对SC细胞的IC50值分别为：50ug/ml、lug/ml;对SC-T细胞的IC50值分别为：120ug/ml、10ug/ml。SC及SC-T细胞对EPI、DOX体现出显著耐药性。盐霉素(SAL)对MCF7/ADM、SC、SC-T三组细胞的IC50值分别为：3±0.2ug/ml、8±0.5ug/ml、9±0.2umol/ml。EPI、DOX及SAL三种药物单独作用于MCF7/ADM、SC、SC-T细胞时,乳腺癌干细胞体现出明显的药物抵抗性,在TGF-β1、作用后药物抵抗更为明显,p<0.01；在两药联用方面,DOX和SAL联用的方式显著优于其他组合,p<0.01。EPI、DOX、SAL三药联用时,三组细胞生长抑制率无明显差异,p>0.1。实验结论：1.TGF-β1可以增加乳腺癌细胞的肿瘤干细胞池,提高细胞周期调控因子p21的表达,使细胞出现G0/G1期阻滞。2.TGF-β1可以上调自我更新和侵袭能力相关的p21、MMP、SATB1、Vimentin基因水平和蛋白水平的表达。3.TGF-β1可以有效富集乳腺癌干细胞。促进乳腺癌干细胞标记物ALDH1的表达,增强细胞自我更新、侵袭能力,诱导乳腺癌细胞化疗耐药。4.针对乳腺癌干细胞杀伤的药物盐霉素可以增加乳腺癌细胞对表阿霉素及多西紫杉醇的敏感性,逆转表阿霉素和多西紫杉醇的耐药,三药联合使用时在中等剂量即可有效杀伤乳腺癌细胞及乳腺癌干细胞。
