背景:脑血管病是人类的常见病和多发病,其以较高的发病率、致残率和病死率成为当前严重威胁人类健康的一类重要疾病,其中以缺血性脑血管病为最常见,但由于缺血后原发性和继发性损伤机制尚未完全明了,所以它一直是各国研究的重点和难题。目前,对于脑缺血/再灌注损伤机制的研究主要集中在氧自由基、兴奋性氨基酸、细胞内钙超载、线粒体损伤、炎症反应和细胞凋亡等方面,其中,再灌注时的炎症反应促进了继发性脑损伤,是脑缺血/再灌注损伤的主要原因之一。脑缺血后星形胶质细胞作为中枢神经系统第一类受损的细胞,出现肥大、增殖,并合成表达多种炎症介质(如NF-κB p65、TNF-α、ICAM-1),启动了免疫级联反应。抗氧化剂吡咯烷二硫基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)能够通过选择性抑制转录因子NF-κB的活性,从而减少因免疫或炎症反应所导致的组织损伤。因此,本课题采用PDTC作为干预手段,了解星形胶质细胞及其表达的炎症介质,对寻找减轻脑缺血后炎症反应损伤的新途径具有重要意义,值得进一步地探索。目的:(1)探讨Wistar大鼠局灶脑缺血/再灌注后反应性星形胶质细胞在脑组织中的形态、数量的时空变化;(2)研究大鼠脑组织星形胶质细胞表达NF-κB p65、TNF-α、ICAM-1的时空规律,探讨星形胶质细胞表达炎症介质在局灶脑缺血/再灌注中的作用机制;(3)进一步评估不同剂量抗氧化剂(PDTC)对大鼠局灶脑缺血/再灌注过程中星形胶质细胞表达炎性介质的影响,并为抗氧化剂进入临床治疗积累理论依据。方法:雄性Wistar大鼠,通过改良线栓法制备大脑中动脉局灶脑缺血2 h/再灌注模型,随机分为正常对照组(NC组),假手术组(SC组),单纯缺血/再灌注组(I/R组),缺血/再灌注+PDTC 50mg.kg-1组(I/RP1),缺血/再灌注+PDTC 100mg.kg-1组(I/RP2),生理盐水组(NS组)。除正常对照组3只大鼠,其余各组根据再灌注时间的不同又分为2h、6h、12h、24h、48h、72h共6个亚组,每个亚组6只大鼠。通过HE染色了解脑梗塞后脑组织的病理学变化。采用免疫组化法检测GFAP、NF-κB p65、TNF-α、ICAM-1的表达。原位杂交法检测NF-κB p65 mRNA、TNF-αmRNA、ICAM-1 mRNA的表达。荧光免疫双标检测NF-κB p65、TNF-α、ICAM-1在星形胶质细胞中的表达。结果:(1)局灶脑缺血/再灌注后24h脑梗死面积最大,PDTC干预组,脑梗塞灶面积明显减小。(2)GFAP免疫组化结果:NC组和SC组可见少量淡染的星形胶质细胞,无反应性增生肥大,细胞轮廓清晰,规律分布。I/R组:再灌注2h,在缺血区可见GFAP染色稍增强的星形胶质细胞,但数量和NC组、SC组相比,无显著性差异(p>0.05);再灌注6h,缺血区GFAP阳性星形胶质细胞增多(p<0.05);再灌注12-72h,缺血区反应性星形胶质细胞明显逐渐增多(p<0.01)。I/RP1组、I/RP2组与I/R组比较GFAP阳性表达明显减弱(p<0.05)。NS组和I/R组基本相似(p>0.05)。(3)NF-κB p65免疫组化结果:脑局灶缺血/再灌注2-12h,NC组NF-κB p65阳性的星形胶质细胞样细胞和其余5组比较无显著性差异(p>0.05)。再灌注24-72h,I/R组的NF-κB p65阳性的星形胶质细胞样细胞开始出现并且逐渐增多(p<0.05),至72h达高峰(p<0.01),与NC组、SC组比较有显著性差异(p<0.05);I/RP1组、I/RP2组与I/R组比较NF-κB p65阳性表达明显减弱(p<0.05);NS组和I/R组基本相似(p>0.05)。(4)TNF-α免疫组化结果:脑局灶缺血/再灌注2-24h,NC组TNF-α阳性的星形胶质细胞样细胞和其余5组比较无显著性差异(p>0.05)。再灌注48-72h,I/R组的TNF-α阳性的星形胶质细胞样细胞开始出现并且逐渐增多(p<0.05),与NC组、SC组比较有显著性差异(p<0.01);I/RP1组、I/RP2组与I/R组比较TNF-α阳性表达明显减弱(p<0.05);NS组和I/R组基本相似(p>0.05)。(5)ICAM-1免疫组化结果:脑局灶缺血/再灌注2-48h,NC组ICAM-1阳性的星形胶质细胞样细胞和其余5组比较无显著性差异(p>0.05)。再灌注72h,I/R组的ICAM-1阳性的星形胶质细胞样细胞开始出现增多(p<0.05),与NC组、SC组比较有显著性差异(p<0.01);I/RP1组、I/RP2组与I/R组比较ICAM-1阳性表达明显减弱(p<0.05);NS组和I/R组基本相似(p>0.05)。(6)NF-κB p65 mRNA原位杂交结果:脑局灶缺血/再灌注2-6h,NC组NF-κB p65 mRNA阳性的星形胶质细胞样细胞和其余5组比较无显著性差异(p>0.05)。再灌注12-24 h,I/R组NF-κB p65 mRNA阳性的星形胶质细胞样细胞逐渐增多(p<0.05)。再灌注48-72 h,I/R组NF-κB p65 mRNA阳性的星形胶质细胞样细胞减少,但仍多于NC组和SC组,有显著性差异(p<0.05);I/RP1组、I/RP2组与I/R组比较NF-κB p65 mRNA阳性的星形胶质细胞样细胞减少,有显著性差异(p<0.05);NS组和I/R组基本相似。(7)TNF-αmRNA原位杂交结果:脑局灶缺血/再灌注2-12h,NC组TNF-αmRNA阳性的星形胶质细胞样细胞和其余5组比较无显著性差异(p>0.05)。再灌注24-72 h,I/R组TNF-αmRNA阳性的星形胶质细胞样细胞逐渐增多(p<0.05); I/RP1组、I/RP2组与I/R组比较TNF-αmRNA阳性的星形胶质细胞样细胞减少,有显著性差异(p<0.05);NS组和I/R组基本相似。(8)ICAM-1 mRNA原位杂交结果:脑局灶缺血/再灌注2-24h,NC组ICAM-1 mRNA阳性的星形胶质细胞样细胞和其余5组比较无显著性差异(p>0.05)。再灌注48-72h,I/R组ICAM-1 mRNA阳性的星形胶质细胞样细胞逐渐增多(p<0.05); I/RP1组、I/RP2组与I/R组比较ICAM-1 mRNA阳性的星形胶质细胞样细胞减少,有显著性差异(p<0.05);NS组和I/R组基本相似。(9)GFAP和NF-κB p65荧光免疫双标结果:局灶脑缺血/再灌注24-72h,缺血边缘区、脑室周及附近区域有出现NF-κB p65和GFAP免疫荧光产物共存,并且逐渐增多。(10)GFAP和TNF-α荧光免疫双标结果:局灶脑缺血/再灌注48-72h,缺血边缘区、脑室周及附近区域有出现TNF-α和GFAP免疫荧光产物共存,并且逐渐增多。(11)GFAP和ICAM-1荧光免疫双标结果:局灶脑缺血/再灌注72h,缺血边缘区、脑室周及附近区域有出现ICAM-1和GFAP免疫荧光产物共存。结论:(1)Wistar大鼠局灶脑缺血/再灌注后早期星形胶质细胞即发生形态变化,在缺血区反应性星形胶质细胞数量大量增加;(2)局灶脑缺血/再灌注早期,星形胶质细胞最先表达NF-κB p65,其次TNF-α,最后ICAM-1,多分布在缺血灶周围;(3)局灶脑缺血/再灌注后,星形胶质细胞中NF-κB p65的活化诱导了TNF-α、ICAM-1的表达;(4)局灶脑缺血/再灌注后,星形胶质细胞中ICAM-1的表达可能受TNF-α的调节;(5)局灶脑缺血/再灌注后,星形胶质细胞表达NF-κB p65、TNF-α、ICAM-1对脑组织有损伤作用;(6)PDTC对大鼠局灶脑缺血/再灌注过程中星形胶质细胞表达NF-κB p65、TNF-α、ICAM-1有抑制作用;50 mg/kg和100 mg/kg的PDTC的抑制作用无明显差异;(7)PDTC在大鼠局灶脑缺血/再灌注过程中的应用,有助于减轻炎症反应,改善神经缺损功能,减轻脑梗死面积。
