TLR4信号通路促进肿瘤细胞分泌MIP-3alpha参与肿瘤免疫逃逸的研究

慢性感染和炎症被认为是导致肿瘤发生和发展的重要原因之一，研究证明促炎性细胞因子和趋化因子长期存在于某部位可能会导致慢性炎症的发生，局部微环境中促炎性细胞因子的长期存在和反复的炎症反应可能诱导肿瘤的发生，但目前对于慢性炎症导致肿瘤发生和发展的相关机制并不十分清楚。肿瘤免疫逃逸发生的机制一直是生物医学领域的研究热点之一，近年来肿瘤细胞表面表达的Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)与肿瘤免疫逃逸的关系倍受关注。TLRs最早是在果蝇体内发现的一种蛋白，在果蝇的胚胎发育过程中发挥着重要的作用，有研究证明TLRs在果蝇的抗真菌感染免疫应答过程中发挥重要的作用。人和小鼠体内相继发现十余种TLRs，对其相应的配体也有了深入的了解。TLR在各种生物体内高度同源，对TLRs的功能以及其相关信号转导机制的研究具有重要的理论意义和应用价值。最初，TLRs被认为只表达在免疫细胞表面，如树突状细胞(Dendritic cells，DC)、巨噬细胞和T、B淋巴细胞等，与其相应的配体结合后可以激活免疫细胞使其分泌大量的促炎性细胞因子和趋化因子，参与活化天然免疫应答和特异性免疫应答，构成机体免疫系统的第一道防线。此外，多种炎症细胞、表皮细胞和内皮细胞等都表达不同的TLRs，与TLRs相应配体结合后被激活，分泌大量的细胞因子和趋化因子，如果分泌水平适当则有利于机体抵抗感染并参与杀伤肿瘤细胞等。但炎症细胞一旦被过度活化，分泌大量的促炎性细胞因子并持久存在，则会对机体造成损伤。以前的大部分研究多数集中于免疫细胞表达的TLRs，对肿瘤细胞的研究相对较少，但现有大量研究发现TLRs不仅表达在免疫细胞表面诱导天然免疫和获得性免疫，肿瘤细胞也高表达该类受体，在其相应配体的刺激下，同样能分泌大量炎症细胞因子和趋化因子，那么，该现象与肿瘤的发生、发展以及肿瘤逃避机体免疫监视之间是否存在着联系呢?我们先前的研究结果表明，TLR4信号可以通过促进人肺癌细胞释放大量免疫抑制性细胞因子，如TGF-β、VEGF、IL-8等和抵抗TNF诱导的肿瘤细胞凋亡，帮助肿瘤逃避机体的免疫攻击。在TLR配体刺激下，肿瘤细胞不仅分泌细胞因子，还分泌大量的趋化因子。几乎所有的肿瘤都被检测到能分泌趋化因子，趋化因子在慢性炎症促进肿瘤的形成和发展的过程中发挥着非常重要的作用。其中一部分是通过吸引单核细胞进入肿瘤微环境，为肿瘤的发展提供生长和血管形成因子，如VEGF、TGF-β、IL-10等；还有大量证据表明，趋化因子可有直接作用于某些表达趋化因子的受体的肿瘤细胞，特别是某些趋化因子可以活化这些肿瘤细胞的抗凋亡通路。另外，与趋化因子反应的肿瘤细胞可有选择性优势利于肿瘤的生长。趋化因子是一类具有高度同源性的低分子量蛋白，在皮摩尔水平就可发挥作用趋化各种类型的白细胞。受此启发，我们设想肿瘤细胞是否可以通过分泌大量的趋化因子，进而吸引更多的不成熟和／或具有免疫抑制性的细胞亚群进入瘤内，继而参与机体的免疫逃逸。MIP-3a(巨噬细胞炎症蛋白)是属于CC亚族的趋化因子，组成性表达在多种来源的上皮细胞，其特异性受体是CC-趋化因子受体6(CCR6)，趋化淋巴细胞和DC。很多浸润大量非成熟DC的实体瘤本身都检测到表达MIP-3a。在以上研究背景和假设的基础上，我们在本课题中选择了几株不同组织来源的小鼠肿瘤细胞株作为研究对象，首先探讨了肿瘤细胞表面TLR4的表达和诱导表达；进一步研究了TLR4信号对肿瘤细胞趋化因子表达谱的影响；分析了肿瘤细胞中的MIP-3a是否能够被诱导表达以及与TLR4信号的相关性；最后对于调控MIP-3a分泌的相关信号通路以及MIP-3a究竟通过怎样的机制促进肿瘤生长和发展等做了初步的探讨。研究结果发现，多数肿瘤细胞如结肠癌细胞株CT26、肺癌细胞株3LL、黑色素瘤细胞株B16和B16F10、纤维瘤细胞株L929和乳腺癌细胞株4T1都组成性地表达TLR4且表达量较高，TLR4的天然配体LPS能上调CT26表达TLR4，但对其它几种肿瘤细胞B16、4T1、3LL的TLR4的表达无明显影响。随后我们用RT-PCR方法检测了TLR4信号对这四种肿瘤细胞趋化因子的表达谱的影响，结果显示，LPS刺激后，四种肿瘤细胞某些免疫抑制性因子和趋化因子的表达变化不尽相同：在检测的四种肿瘤细胞中均组成性表达MCP-1，LPS诱导后无明显变化；RNATES在两种肿瘤细胞中(B16，CT26)组成性表达，LPS诱导后无明显变化，但LPS刺激12h后在4T1肿瘤细胞中RNATES表达增加，而在3LL肿瘤细胞中，LPS却下调RNATES表达；趋化因子IP-10只有在4T1细胞中受LPS刺激后上调其表达；LPS上调3LL细胞的VEGF的表达以及3LL和CT26中TECK的表达；LPS上调3LL、B16、CT26细胞中MIP-3a的表达，其中CT26细胞株的变化最为明显。因TLR4信号对不同组织来源的肿瘤细胞趋化因子表达谱的影响不尽相同，但MIP-3a的变化基本一致，MIP-3a是能够显著趋化不成熟DC和T细胞的重要趋化因子，肿瘤微环境中存在的TGF-β、VEGF、IL-8等大量抑制性细胞因子可阻滞DC的分化成熟，或者诱导分化为某些调节性DC。因此，我们推测TLR4信号是否可以通过促进肿瘤细胞MIP-3a的分泌而参与机体的肿瘤免疫逃逸呢?因CT26结肠癌细胞株在LPS刺激下，MIP-3a变化最为显著，因此我们在以下的试验中选取了CT26结肠癌细胞株作为肿瘤细胞模型，进一步研究TLR4信号对MIP-3a的分泌及相关分子信号机制，以及MIP-3a与肿瘤免疫逃逸的相关性。RT-PCR结果显示，CT26在静息状态下MIP-3a水平非常低，但在LPS刺激后其表达水平逐渐升高，刺激1h水平最高，后逐渐降低，但仍高于静息状态。随后采用ELISA的方法检测了MIP-3a的蛋白水平表达，CT26铺板过夜后，加入1μg／ml LPS刺激，分别在第6、12、24、36、48小时收取细胞的培养上清，检测其中MIP-3a的含量。结果显示，在CT26在静息状态下MIP-3a分泌水平比较低，但在LPS刺激后分泌水平显著升高。TLR4信号能够促进小鼠结肠癌细胞CT26分泌趋化因子MIP-3a。那么，其可能的分子信号机制如何呢?首先我们对MAPKs和NF-κB两条信号途径进行研究，结果发现，结肠癌细胞CT26在静息状态下MAPKs激酶中p38、ERK1／2和JNK1／2信号分子的磷酸化水平表达不高，LPS的刺激后，这三种信号分子的磷酸化水平都显著增加。同样地，LPS的刺激后的小鼠结肠癌细胞CT26中NF-κB信号途径也被激活，表现在胞浆内磷酸化的IκBa降解及核内NF-κB蛋白表达增高。但究竟是哪条或哪些通路参与了LPS诱导的MIP-3a的分泌呢?我们利用相关信号分子特异性的抑制剂SB203580、U0126、SP600125和PDTC分别阻断p38、ERK1／2、JNK1／2和NF-κB信号通路后，ELISA检测MIP-3a的分泌量，结果显示ERK1／2和NF-κB特异性的抑制剂U0126和PDTC明显抑制了LPS诱导的MIP-3a的分泌，可推断ERK和NF-κB信号通路的活化与CT26分泌MIP-3a直接相关；有趣的是，研究结果显示JNK抑制剂SP600125不但没有阻断MIP-3a的分泌，反而促进了MIP-3a分泌，那么，其相关机制怎样呢?我们推测SP600125是否可能通过激活ERK和NF-κB信号通路，从而促进了MIP-3a的分泌。因此，我们进一步检测了JNK抑制剂SP600125作用后CT26细胞内ERK和p-IκB的活化情况，结果发现，JNK抑制剂明显激活ERK的磷酸化水平，但对p-IκB的磷酸化水平并没有明显影响，表明JNK抑制剂可以通过活化ERK信号通路促进MIP-3a分泌增加。以上研究结果显示，TLR4信号可以通过激活ERK和NF-κB信号通路，增加肿瘤细胞MIP-3a的分泌。那么，MIP-3a的分泌如何参与TLR4信号介导的肿瘤细胞免疫逃逸?近年来大量文献报道MIP-3a能趋化不成熟DC，并促进肿瘤细胞的生长。为了阐明TLR4信号介导MIP-3a的分泌是否参与结肠癌细胞CT26的免疫逃逸，我们首先利用Transwell系统检测了MIP-3a对非成熟DC(immature DC，imDC)的趋化作用，CT26细胞经LPS刺激和未刺激，在第36小时收集培养上清，重组MIP-3a蛋白100ng／ml作为阳性对照。结果发现，LPS刺激的CT26肿瘤细胞培养上清对非成熟DC的趋化作用显著高于未刺激细胞的培养上清，且趋化非成熟DC的细胞数量与阳性对照组相当，为了明确肿瘤培养上清MIP-3a的作用，我们利用抗MIP-3a的中和性抗体100ug／ml对MIP-3a进行阻断，结果显示，MIP-3a的中和性抗体阻断组显著降低了肿瘤培养上清对非成熟DC的趋化作用，进一步证实肿瘤培养上清中MIP-3a在趋化非成熟DC过程中发挥了重要作用。有文献报道，趋化因子的存在可以促进肿瘤的发展，某些趋化因子能促进肿瘤细胞的增殖，从而增进肿瘤的生长。MIP-3a是否能够直接促进CT26肿瘤细胞的增殖呢?我们用CFSE标记CT26细胞，用不同浓度LPS在不同时间点刺激后，FACS检测细胞的增殖情况，结果显示，在LPS的不同作用时间点、各种浓度的LPS对CT26的增殖并没有明显的促进作用。综上所述，肿瘤细胞表面组成性和／或诱导性地表达TLR4，TLR4信号可以通过活化CT26肿瘤细胞的ERK和NF-κB信号通路，促进MIP-3a的分泌，促分泌的MIP-3a继而通过趋化非成熟DC进入肿瘤周围参与TLR4信号介导的肿瘤免疫逃逸。本实验结果将有助于了解炎症反应后TLR4信号途径活化促进肿瘤发展的分子机制和两者之间的相互关系，为临床治疗慢性炎症引起的肿瘤提供了新的认识和切入点，对TLRs信号在肿瘤生物学和肿瘤免疫学的功能增添了新的认识。