重组梅毒螺旋体抗原TpN17的纯化及基于金磁微粒梅毒螺旋体抗体的检测
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梅毒是严重危害人类健康的传染病之一,其病原体为梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)。血清梅毒抗体水平是诊断梅毒螺旋体感染的主要指标,传统方法包括性病实验室研究试验、荧光螺旋体吸收试验和梅毒螺旋体血球凝集试验等。近年来,以酶标板为载体的梅毒螺旋体IgM和IgG抗体的检测已被用于临床检验和血站血液筛查。本研究工作包括两个部分:1.梅毒螺旋体抗原TpN17在毕赤酵母中的表达与纯化。2.以金磁微粒为载体,利用纯化得到的TpN17抗原和市售梅毒螺旋体混合抗原(TpN15,TpN17,TpN47)建立针对梅毒螺旋体抗体的双抗原夹心检测方法。通过甲醇诱导,毕赤酵母表达系统中表达重组梅毒螺旋体抗原TpN17,样品经饱和硫酸铵沉淀粗提后,以阳离子层析交换柱对表达的TpN17进行进一步纯化。结果表明,样品经硫酸铵沉淀、PB复溶后以阳离子交换层析柱进行纯化,NaCl浓度梯度洗脱,可获得纯度大于90%的重组梅毒螺旋体抗原TpN17。Bradford法测定蛋白浓度为0.66 mg/mL。用过碘酸钠法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到抗原TpN17上,双抗原夹心法测定HRP-TpN17滴度为1:3,200,作为包被的TpN17和标记抗原HRP-TpN17可用于梅毒螺旋体抗体的检测。金磁微粒(Fe3O4/Au)是结合磁性氧化物粒子和胶体金特点的新型磁性复合微粒,组装结构的金磁微粒具有磁性Fe3O4核,表面组装有大量纳米级金粒子,集胶体金对生物分子的快速固定化和磁性纳米粒子在外磁场可分离性于一体,在免疫学检测领域具有重要的应用价值。利用双抗原夹心法原理,以纯化得到的TpN17和标记抗原HRP-TpN17,初步建立了基于金磁微粒的梅毒螺旋体抗体的检测方法。金磁微粒表面形成夹心复合物后以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物显色,磁性分离后测定上清液在450nm处吸光度值。结果表明,在固定抗原量为480ng/管、HRP-标记抗原稀释度为1:1,600时,阳性血清的检测值可达1.7以上,对已确诊患者血清样本的检测表明,该方法的阳性检出率为93.3%,还存在6.7%的漏检率,说明方法的灵敏度和特异性还有待改进。为完善以金磁微粒为载体检测梅毒抗体的方法,采用市售的重组梅毒螺旋体混合抗原(TpN47,TpN17,TpN15)对梅毒螺旋体抗体进行检测。将固定有混合抗原的金磁微粒与血清(或血浆)及HRP-标记混合抗原在37℃温育30 min后以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物显色,磁性分离后测定上清液在450 nm处吸光度值。对方法的临界值、重复性、灵敏度、特异性等参数进行确定。方阵滴定结果表明固定抗原量为420 ng/孔、HRP-标记抗原稀释度为1∶4,000为最佳反应条件。本方法批内变异系数(CV)值在5%以下,批间CV值为6.82%,符合免疫学载体的要求。该方法与以酶标板为载体的商品化试剂盒检测结果符合率为100%,灵敏度是商品化试剂盒的10倍。所建立基于金磁微粒的梅毒螺旋体抗体检测方法具有潜在的应用价值。
中文摘要 | 第4-6页 |
ABSTRACT | 第6-7页 |
缩略词表 | 第11-12页 |
引言 | 第12-14页 |
第一章 文献综述 | 第14-32页 |
1 梅毒的研究进展 | 第14-18页 |
1.1 梅毒的流行病学 | 第14-15页 |
1.2 梅毒螺旋体生物学特征和结构 | 第15-17页 |
1.3 致病机理及临床表现 | 第17-18页 |
2 梅毒螺旋体的检测 | 第18-22页 |
2.1 梅毒螺旋体病原学检测 | 第18-19页 |
2.1.1 暗视野显微镜法 | 第18-19页 |
2.1.2 梅毒螺旋体镀银染色法 | 第19页 |
2.1.3 梅毒螺旋体免疫荧光染色法 | 第19页 |
2.2 梅毒螺旋体血清学检测 | 第19-22页 |
2.2.1 非特异性梅毒螺旋体抗原血清学试验 | 第20页 |
2.2.2 特异性梅毒螺旋体抗原血清学试验 | 第20-22页 |
3 梅毒螺旋体抗原及其在梅毒螺旋体抗体检测中的应用 | 第22-24页 |
4 免疫磁珠及其应用 | 第24-32页 |
4.1 磁分离酶联免疫法原理 | 第26-28页 |
4.2 磁分离酶联免疫法的应用 | 第28-29页 |
4.3 金磁微粒及在免疫学检测中的应用 | 第29-32页 |
第二章 重组梅毒螺旋体抗原TpN17的纯化 | 第32-47页 |
1 材料与方法 | 第32-38页 |
1.1 材料 | 第32-35页 |
1.1.1 试剂与样品 | 第32-34页 |
1.1.2 仪器 | 第34-35页 |
1.2 方法 | 第35-38页 |
1.2.1 毕赤酵母菌株GS115对重组体pPIC9K-Tpp17的表达 | 第35页 |
1.2.2 确定TpN17抗原最佳(NH_4)_2SO_4沉淀饱和度 | 第35页 |
1.2.3 离子交换层析条件的选择与样品的预处理 | 第35-37页 |
1.2.4 SDS-PAGE分析纯化结果 | 第37-38页 |
1.2.5 纯化抗原的浓度测定 | 第38页 |
1.2.6 纯化抗原的标记及其滴度测定 | 第38页 |
2 结果与讨论 | 第38-45页 |
2.1 TpN17抗原最佳(NH_4)_2SO_4沉淀饱和度 | 第38-39页 |
2.2 层析系统的选择 | 第39-41页 |
2.2.1 上样缓冲液pH值的选择 | 第39-40页 |
2.2.2 洗脱缓冲液离子强度的选择 | 第40-41页 |
2.3 纯化过程的放大 | 第41-42页 |
2.4 与商品化抗原的SDS-PAGE对比 | 第42-43页 |
2.5 纯化抗原的浓度测定 | 第43-44页 |
2.6 HRP标记TpN17抗原及其滴度测定 | 第44-45页 |
2.6.1 标记步骤 | 第44页 |
2.6.2 双抗原夹心法测定标记抗原滴度 | 第44-45页 |
3 结论 | 第45-47页 |
第三章 以金磁微粒为载体检测梅毒螺旋体抗体 | 第47-64页 |
1 材料与方法 | 第47-51页 |
1.1 材料 | 第47-48页 |
1.1.1 试剂与样品 | 第47-48页 |
1.1.2 仪器 | 第48页 |
1.2 方法 | 第48-51页 |
1.2.1 应用金磁微粒检测梅毒螺旋体抗体的原理 | 第49页 |
1.2.2 固定 | 第49-50页 |
1.2.3 封闭 | 第50页 |
1.2.4 双抗原夹心法检测梅毒螺旋体抗体基本步骤 | 第50页 |
1.2.5 双抗原夹心法检测梅毒螺旋体抗体条件的优选 | 第50-51页 |
1.2.6 献血者筛查中的初步应用 | 第51页 |
2 结果与讨论 | 第51-62页 |
2.1 金磁微粒的性质及抗原在其表面的固定化 | 第51-52页 |
2.2 TpN17抗原用于双抗原夹心法检测梅毒螺旋体抗体 | 第52-55页 |
2.2.1 检测梅毒螺旋体抗体条件的优选 | 第52-53页 |
2.2.2 与商品化TpN17抗原的比较 | 第53页 |
2.2.3 献血筛查中的初步应用 | 第53-55页 |
2.3 商品化抗原TpN47、TpN17和TpN15用于双抗原夹心法检测梅毒螺旋体抗体 | 第55-62页 |
2.3.1 封闭缓冲液的选择 | 第55-56页 |
2.3.2 固定抗原量和HRP-标记抗原最佳工作浓度的选择 | 第56-57页 |
2.3.3 温育时间的选择 | 第57-58页 |
2.3.4 临界值的确定 | 第58-59页 |
2.3.5 检测系统的灵敏度分析 | 第59-60页 |
2.3.6 方法的精密度分析 | 第60-61页 |
2.3.7 系统的特异性分析 | 第61-62页 |
3 结论 | 第62-64页 |
全文小结 | 第64-65页 |
参考文献 | 第65-75页 |
致谢 | 第75页 |
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