研究背景血管内皮的完整和功能的正常对于维持血流通畅具有重要意义。大量研究资料表明,吸烟可以损伤血管内皮细胞,导致内皮细胞功能障碍,引发血栓的形成。近年来,内皮细胞蛋白C受体(endothelial cell protein C receptor, EPCR)与血栓形成的关系引起学术界的高度重视。当各种因素导致内皮细胞受损时,膜联EPCR(membrane associated EPCR, mEPCR)由内皮细胞脱落,致使可溶性EPCR (soluble EPCR, sEPCR)浓度升高,使血栓形成的风险显著增加。因此,测定sEPCR含量的变化成为反映血栓形成的敏感指标之一辛伐他汀除其调脂作用之外,还具有内皮保护、抗凝、抑制血小板聚集与抗炎等作用。辛伐他汀是否可以改善香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)介导的内皮细胞凝血功能障碍,尚未见报道。目的研究不同条件CSE对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)表达可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)和膜联内皮细胞蛋白C受体(mEPCR)的影响及辛伐他汀的干预作用。方法采用HUVECs细胞株进行以下实验。(1)CSE对HUVECs表达sEPCR的时间及浓度依赖性：HUVECs培养后接种于24孔培养板中,随机分为对照组及实验组,进行以下研究。①CSE作用的浓度依赖性：分别用0%、2.5%、5%及10%的CSE孵育细胞,8h后收集各组上清液；②CSE作用的时间依赖性：用5%CSE与细胞分别孵育0、4、8、12及24h,每组均设立对照,收集各组上清液。采用酶联免疫吸附双抗体夹心分析法(ELISA)测定各组上清液中sEPCR的含量。(2)辛伐他汀的干预作用：HUVECs培养后接种于25cm×25cm的培养瓶中,随机分为对照组、5%CSE组、不同浓度辛伐他汀组及辛伐他汀干预组。对照组培养液中不加任何干预；辛伐他汀组分别加入终浓度为50、100、200μ mol/L的辛伐他汀液孵育24h,辛伐他汀干预组先以50、100、200μ mol/L的辛伐他汀预处理细胞2h,再与5%CSE孵育24h。收集各组的细胞及上清液,ELISA法检测上清液中sEPCR蛋白含量,实时定量PCR法检测各组细胞中mEPCR mRNA的表达。结果(1)CSE对HUVECs表达sEPCR的时间及浓度依赖性：①HUVECs与不同浓度CSE孵育8h后,5%、10%CSE组与对照组比较,sEPCR表达明显升高,差异有统计学意义,(均P<0.05),2.5%CSE组升高与对照组比较则无统计学意义(P>0.05),5%、10%CSE两组间差异无统计学意义(P>0.05)；②HUVECs与5%CSE组分别孵育0、4、8、12及24h后,不同时间点5%CSE组sEPCR表达均高于对照组,其中8、12、24h组与对照组比较,差异有统计学意义(均P<0.05),且呈时间依赖性。(2)辛伐他汀的干预作用：①5%CSE组sEPCR蛋白含量高于对照组,mEPCR mRNA表达低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)；②100μ mol/L与200μ mol/L辛伐他汀组sEPCR蛋白含量均高于对照组,低于5%CSE组,其mEPCR mRNA表达均低于对照组,高于5%CSE组,差异均有统计学意义(均P<0.05)；③各辛伐他汀干预组sEPCR蛋白含量均低于5%CSE组,但高于对照组及相应浓度的辛伐他汀组；相反,各辛伐他汀干预组mEPCR mRNA表达均高于5%CSE组,低于对照组及相应浓度的辛伐他汀组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论(1) EPCR的异常表达可能是CSE引起内皮细胞凝血功能障碍的机制之一(2)在体外,辛伐他汀通过上调HUVECs mEPCR mRNA的表达,降低sEPCR的分泌,对CSE介导的内皮细胞凝血功能障碍具有一定的改善作用。
