睾丸巨噬细胞对睾丸间质细胞功能和形态影响的体外研究

目的：本实验应用细胞培养、HE染色、组织化学染色、磁分离均相酶联免疫（磁酶免）睾酮定量测定法等技术方法，研究了经脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）激活或未激活的睾丸巨噬细胞(testicular macrophage,TM)及腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PM)对睾丸间质细胞(Leydig 细胞)的体外作用。主要观察不同浓度的巨噬细胞培养基(macrophag-conditioned media, MCM)在不同时间对Leydig 细胞分泌的基础睾酮的影响，以及对Leydig 细胞形态的影响，同时对巨噬细胞分泌的一种细胞因子－白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）的作用也进行了分析，以期进一步了解睾丸在生理及病理状态下TM与Leydig 细胞相互作用的机制，探讨睾丸生精微环境维持和紊乱的影响因素，为临床诊治免疫性不育提供参考。方法：实验选用健康成年雄性Wistar大鼠，体重200g左右，分离得到睾丸巨噬细胞、腹腔巨噬细胞及Leydig 细胞，进行以下研究：1 分别制备LPS(50μg/ml)激活24h的睾丸或腹腔巨噬细胞条件培养基（LPS-TMCM-24h、LPS-PMCM-24h）、LPS激活48h的睾丸或腹腔巨噬细胞条件培养基（LPS-TMCM-48h、LPS-PMCM-48h）；同时制备未加<WP=4>LPS的TM及PM培养上清，分别得到TMCM-24h、PMCM-24h、TMCM-48h和PMCM-48h四种条件培养基。2 每组分不同浓度（0%、5%、10%、20%、30%、40%和50%, 即MCM占24孔培养板每孔液体总体积的百分比）分别加入Leydig 细胞培养基内，并设立只加LPS的空白组（观察LPS对Leydig细胞有没有直接作用），24h后取上清，用瑞士雪兰诺Ⅰ型内分泌定量测定仪测量Leydig 细胞上清中的睾酮含量。确定巨噬细胞条件培养基的最佳刺激浓度。3 按照以上得到的最佳浓度测定LPS-TMCM-24h在不同时间内（1h、6h、12h、24h、48h、72h, 即从加入LPS-TMCM-24h开始计时）对Leydig细胞上清睾酮含量的影响，确定最佳刺激时间；同时设立对照组(单独培养Leydig细胞，不加LPS-TMCM-24h)。4 人重组IL-1β作为单独的影响因素，加入Leydig 细胞内，测量方法同上。5 Leydig 细胞分两组，一组单独培养，一组加入LPS-TMCM-24h，应用计数法测定培养24h、48h、72h、96h和120h的Leydig 细胞的数量，比较两组细胞增殖的情况。6 Leydig 细胞中分别加入LPS-TMCM-24h、LPS-PMCM-24h、TMCM-24h、PMCM-24h、IL-1和设立对照组，培养24h后进行HE染色。7 部分Leydig 细胞培养于24孔板中的玻璃盖片上，分两组，一组作对照，一组加入LPS-TMCM-24h，培养24h后进行乳酸脱氢酶（LDH）染色。结果经计算机图象分<WP=5>析系统进行细胞阳性反应颗粒光密度（反映细胞内该酶的活性）测定。8 所有结果经SPSS10.0统计分析软件进行统计学处理。睾酮值和细胞计数值多组间比较应用方差分析, 两组间细胞阳性反应颗粒光密度比较应用t检验。结果: 1 分离细胞及纯度鉴定1.1 总的睾丸间质内的细胞：经过Ⅰ型胶原酶及机械法的作用，大部分间质内的细胞都已经消化下来，而曲细精管保持完整，表面光滑，基本没有断裂。1.2 TM：培养30min后TM迅速贴壁，呈圆形或椭圆形，细胞周边部可见小的突起，整个细胞中间稍厚，四周较薄，呈油煎蛋样。非特异性酯酶（NSE）染色鉴定阳性率达90%以上。1.3 PM：培养30min后PM迅速贴壁，形态多样，有圆形、椭圆形、长梭形等，可能与其所处的功能状态不同有关。NSE染色阳性率95%以上。1.4 Leydig细胞：培养24h后，活性良好的Leydig细胞大部分已贴壁，典型的呈多边形、三角形，核大，胞质呈均匀的细颗粒状，相差显微镜下可见为细小均一的脂滴。3β羟胆固醇脱氢酶(3β-HSD)染色阳性率达80%以上。2 最佳刺激浓度的确定2.1 LPS-TMCM-24h使Leydig细胞上清中睾酮含量增加，对Leydig细胞基础睾酮合成具有促进作用，其中LPS-TMCM-24h浓度为20%时达到最大值（0.412±<WP=6>0.052ng/ml），与对照组（0.201±0.039ng/ml）比较P<0.01，即20%为最佳刺激浓度。2.2 LPS-PMCM-24h、TMCM-48h使Leydig细胞上清中睾酮含量减少，对Leydig细胞基础睾酮合成具有抑制作用。其中LPS-PMCM-24h 浓度为20%、30%、40%、50%时其睾酮含量分别为0.270±0.076， 0.310±0.032, 0.285±0.058, 0.256±0.108ng/ml与对照组（0.479±0.048ng/ml）比较P<0.01；TMCM-48h浓度为5%、10%、40%时其睾酮含量分别为0.170±0.031, 0.180±0.043, 0.142±0.013ng/ml与对照组（0.247±0.054ng/ml）比较，睾酮含量明显降低（P<0.05）。2.3 TMCM-24h、PMCM-24h、LPS-TMCM-48h、LPS-PMCM-48h、PMCM-48h对Leydig细胞基础睾酮合成无明显影响，各浓度与对照组比较无明显差别（P>0.05）。2.4 IL-1β在浓度为12U/ml时抑制Leydig细胞基础睾酮合成的程度最大，加入12U/ml 的IL-1β时睾酮含量为0.394±0.071ng/ml，对照组为0.635±0.098ng/ml（P<0.05）。2.5 LPS单独影响：LPS对Leydig细胞基础睾酮合成无明显影响，各浓度（10%，20%，30%）组与对照组比较无明显差别（P>0.05）。3 最佳刺激时间的确定：从加入LPS-TMCM-24h开始计时到48h之前Leydig细胞上清中的睾酮逐渐增加，48h时达到最高值（0.455±0.055ng/ml），48h后开始下?