目的:构建编码屋尘螨T细胞抗原表位Der p1 T基因的原核表达载体pET28a(+)-Der p1 T并进行大规模诱导表达和纯化,研究屋尘螨粗提液处理小鼠肺上皮细胞所产生的细胞效应及其具体分子机制,探讨用重组蛋白Der p1 T免疫治疗过敏性哮喘小鼠后体内免疫细胞群落变化并评估重组蛋白Der p1 T对过敏性哮喘的治疗效果。方法:根据已报到的屋尘螨Der p1(Gen BankNo.U11695.1)的5个T细胞表(T1-T5),按照T1-T2-T3-T4-T5的连接方式串联其核苷酸序列并插入到大肠杆菌表达载体pET28 a(+)中,形成原核表达重组质粒pET28 a(+)-Der p1 T,并通过限制性内切酶双酶切和基因测序等方法对其进行验证,从而克隆该抗原表位基因(Der p1 T)。将构建成功的重组质粒pET28 a(+)-Der p1 T转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中,首先用小剂量不同浓度梯度的IPTG对重组基因进行诱导表达,最后以最佳浓度及条件进行大规模的诱导表达和纯化。利用屋尘螨粗提液处理体外培养的小鼠肺上皮细胞MLE12,Real time PCR检测编码相关炎症因子和趋化因子的基因的表达变化,Western blot分析相关炎症因子和趋化因子的蛋白水平及炎症通路NF-κB和MAPK的活化情况。利用RNA干扰技术特异性敲减TLR4、MyD88和TRAF6的表达水平,Real time PCR验证敲减效率,Western blot分析屋尘螨粗提液处理相关炎症因子和趋化因子的水平。以屋尘螨粗提液致敏小鼠,构建过敏性哮喘小鼠模型,用纯化的Der p1 T融合肽对哮喘小鼠进行特异性免疫治疗。记录各实验组小鼠症状和体征变化;ELISA试剂盒检测支气管肺泡灌洗液中细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、和IL-17A的水平以及血清中Ig E和Ig G2 a抗体水平;流式细胞技术分析TH1/TH2及TH17/Treg细胞群落的改变;病理切片HE染色显微镜下观察肺组织病理形态。结果:双酶切反应和基因测序结果显示,重组质粒pET28a(+)-Der p1 T构建成功。SDS-PAGE结果显示1.0 mmol/L的IPTG即可有效地诱导Der p1 T的表达,Western blot结果表明纯化后的Der p1 T蛋白无明显杂带。Real time PCR及Western blot结果表明屋尘螨粗提液处理小鼠肺上皮细胞24 h后可显著上调TNF-α、IL-8、IL-25、TGF-β、MCP-1及Eotaxin的表达。屋尘螨粗提液处理MLE12细胞15 min后可以显著诱导p65和JNK的磷酸化。敲减TLR4、MyD88及TRAF6均可以显著抑制屋尘螨粗提液诱导的COX-2和MCP-1的表达。屋尘螨过敏性哮喘小鼠经Der p1 T重组蛋白特异性免疫治疗后,特异性免疫治疗(SIT)组相较于哮喘组症状有所改善,血清中抗体Ig E明显降低(P<0.01),而血清中Ig G2 a抗体浓度显著升高(P<0.01);SIT组小鼠肺泡灌洗液中细胞因子IL-4和IL-17A的水平明显低于哮喘组(P<0.01、P<0.01);而SIT组小鼠肺泡灌洗液中细胞因子IFN-γ和IL-10的水平则明显高于哮喘组(P<0.05、P<0.01)。相应地,流式细胞术的结果显示:与哮喘组小鼠相比,SIT组小鼠脾脏中TH1细胞数量显著增高(P<0.05),TH2细胞数量则明显减少(P<0.05);同时SIT组小鼠脾脏中TH17细胞数量相较于哮喘组明显减少(P<0.05),而Treg细胞则明显增多(P<0.05)。肺组织病理切片结果表明,Der p1 T重组蛋白特异性免疫治疗可以有效地缓解气道周围的炎性细胞浸润。结论:屋尘螨粗提液可以显著上调肺上皮细胞中TNF-α、IL-8、IL-25、TGF-β、MCP-1及Eotaxin的表达。屋尘螨粗提液主要通过TLR4-MyD88-TRAF6轴激活NF-κB及JNK信号通路来开启关键炎症因子和趋化因子的转录表达。Der p1 T融合肽疫苗特异性免疫治疗哮喘小鼠具有很好的治疗效果。我们的研究为临床治疗尘螨过敏性哮喘提供了坚实的理论基础。
