水稻内源非编码小RNA的多样性

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近年来,发现真核生物细胞中小RNA具有降解mRNA,抑制蛋白质翻译,修饰染色质,抵御病毒侵袭,抑制转座子转位等重要的调控作用。不同的调节功能是由不同类型的小RNA执行,所以小RNA类型的多样性表明它们在细胞发育中的功能多样性。本研究通过构建水稻小分子RNA的cDNA文库,分析探讨水稻中小RNA的多样性。结果如下: 1.分别提取水稻9311(Oryza sativa indica.)叶和花药的总RNA,分离其中15-35碱基的小分子RNA。然后分别在其5′和3′端加上连接头,反转录。反转录产物经PCR扩增,限制性内切酶EcoRⅠ酶切,再连接。分离出其中200-800碱基片段,转入PGEM-T载体,转化,即构建成水稻小分子RNA的cDNA文库。 2.从cDNA文库中挑选阳性克隆,114个克隆来自水稻花药,55个源于叶片cDNA文库,共169个克隆测序成功,获得162个单一序列的小分子RNA。这些小分子RNA长度介于16-35碱基,大部分集中于21-22碱基以及24碱基处。比对水稻(9311和日本晴)基因组数据,发现129个序列与已知的基因组序列完全相同,占整个序列总数的79.6%,其中包括47个与非编码看家RNA同源,10个为转运RNA(tRNA),34个为核糖体RNA(rRNA),1个为小核RNA(snRNA)和2个是小核仁RNA(snoRNA)。另外有2个与其它植物叶绿体序列同源。剩余31个小RNA(22.8%)则含有一或多个不配对碱基。 3.小RNA碱基序列的多样性,决定了其作用目标的多样性,表现为其功能的多样性。通过miRU搜索发现它们可能的作用目标有转座子和反转座子蛋白,假设蛋白,表达蛋白,转录因子,F-box家族蛋白,含亮氨酸重复区,植物蛋白家族,翻译起始因子elF-5A,胚胎发生跨膜蛋白,非顶端分生组织家族蛋白,DNA依赖的RNA聚合酶Ⅱ的亚基,Poly(A)结合蛋白,染色质结构调控因子,泛素结合酶(E2),泛素碳端水解酶,DEAD/DEAH box解螺旋酶,钾离子通道调控因子,Piwi结构域,推定的抗病蛋白,DNA错配修复蛋白等等。 4.根据Vector NTI 8定位所得小RNA序列在9311染色体上分布,发现小RNA在染色体上分布与染色体的长度有一定的关联,最长的Ⅰ号染色体上位点最多,最短的X号染色体则最少。发现小RNA大都位于重复序列中或者其附近。20个rasiRNA位于重复
中文摘要第4-7页
英文摘要第7页
目录第11-14页
1.引言第14-47页
    1.1 小RNA的种类第14-33页
        1.1.1 干扰小RNA第14-24页
            1.1.1.1 siRNA的发现第14-16页
            1.1.1.2 siRNA介导RNA干扰的分子机制第16页
            1.1.1.3 siRNA的功能第16-18页
            1.1.1.4 RNAi技术的应用第18-24页
                1.1.1.4.1 siRNA的设计第18页
                1.1.1.4.2 siRNA的合成第18-22页
                1.1.1.4.3 RNA干扰技术的利用第22-24页
        1.1.2 microRNA(miRNA)第24-32页
            1.1.2.1 miRNA的发现及其特性第24-25页
            1.1.2.2 miRNA基因鉴定及其表达标准第25-26页
            1.1.2.3 miRNA的克隆第26-27页
            1.1.2.4 miRNA转录成熟第27-28页
            1.1.2.5 miRNA的作用机制第28页
            1.1.2.6 动物和植物中的miRNA第28-29页
            1.1.2.7 siRNA和miRNA的比较第29页
            1.1.2.8 miRNA目标预测第29-30页
            1.1.2.9 miRNA生物学功能第30-32页
                1.1.2.9.1 动物中miRNA第30-32页
                1.1.2.9.2 植物中miRNA的功能第32页
        1.1.3 微小非编码RNA(tncRNA)第32-33页
        1.1.4 调节性小双链RNA(smRNAs)第33页
        1.1.5 Trans-acting siRNA(tasiRNA)第33页
    1.2 与微小RNA生物产生及其功能发生相关的部分蛋白第33-41页
        1.2.1 核糖核酸酶Ⅲ超家族第33-37页
            1.2.1.1 细菌核糖核酸酶Ⅲ第34-35页
                1.2.1.1.1 细菌核糖核酸酶Ⅲ功能第34-35页
            1.2.1.2 酵母核糖核酸酶Ⅲ第35页
            1.2.1.3 高等真核生物核糖核酸酶Ⅲ第35-37页
                1.2.1.3.1 DICER第36-37页
                1.2.1.3.2 Drosha第37页
        1.2.2 Argonaute家族蛋白第37-39页
        1.2.3 RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)第39-41页
        1.2.4 RNA聚合酶Ⅳ(RNA polymerase Ⅳ)第41页
        1.2.5 RISC(RNA iducing silence complex)第41页
    1.3 水稻基因组计划及其生物信息学第41-44页
        1.3.1 水稻基因组计划的概况第42-44页
        1.3.2 水稻生物信息学第44页
    1.4 本研究的目的与意义第44-47页
2.材料与方法第47-60页
    2.1 材料种植和准备第47页
    2.2 总RNA的提取第47-48页
    2.3 阴离子交换层析分离小片段RNA第48页
    2.4 变性聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶分离小RNA片段第48-51页
    2.5 小RNA的克隆第51-54页
    2.6 小RNA片段分析第54页
    2.7 小RNA在染色体的分布第54页
    2.8 Northen blot杂交第54-56页
    2.9 快速扩增cDNA末端(RACE)第56-57页
    2.10 Dicer-like全长cDNA的获得第57-58页
    2.11 Dicer-like基因的克隆第58-60页
3.结果与分析第60-86页
    3.1 水稻中小RNA第60-64页
        3.1.1 水稻小RNA群体第60-62页
        3.1.2 小RNA在水稻9311染色体位置分布第62页
        3.1.3 部分重叠小RNA第62-63页
        3.1.4 小RNA簇第63-64页
    3.2 水稻中的miRNA第64-74页
        3.2.1 水稻中17个miRNA第64-67页
        3.2.2 前体和microRNA长度的多样性第67-68页
        3.2.3 miRNA在基因组中的位置第68页
        3.2.4 miRNA的目标第68-70页
        3.2.5 m29作用目标克隆第70-74页
        3.2.6 小RNA附近的茎环结构第74页
    3.3 与重复序列相关的小干扰RNA(rasiRNAs)第74-76页
    3.4 微小非编码RNA第76页
    3.5 水稻中的RNase Ⅲ以及Dicer-like基因第76-86页
        3.5.1 水稻中的RNase Ⅲ家族第76-79页
        3.5.2 籼稻中一个Dicer-like基因第79-84页
        3.5.3 Dicer-like基因的表达第84-86页
4.讨论第86-95页
    4.1 植物中微小RNA多样性第86-88页
    4.2 microRNA及其功能第88-89页
    4.3 siRNA和rasiRNA第89页
    4.4 小RNA与逆境第89-90页
    4.5 小RNA与看家非编码RNA第90-91页
    4.6 小RNA与花药中小孢子发育第91-92页
    4.7 小RNA研究的方法与策略第92-93页
    4.8 植物中DCL(Dicer-like)第93-95页
结论第95-97页
参考文献第97-115页
附录Ⅰ第115-135页
附录Ⅱ 英文缩写第135-136页
在读期间发表的论文第136-137页
致谢第137页
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