致病杆菌属CB6菌株的鉴定及菌株选育的初探

存在于昆虫病原线虫肠道内的共生菌，经细菌学家鉴定，将其归属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）。近年来研究表明，其代谢产物可产生多种有生物活性的新结构物质，使其成为具有极大开发潜力和应用前景的一类新型生物资源。我国昆虫病原线虫共生菌资源丰富，已分离获得了较多的共生菌菌株，而对共生菌的分类研究十分缺乏，至今尚未见有系统分类鉴定共生菌的报道。国际上对共生菌已定名的两个属为：致病杆菌属（Xenorhabdus）和光杆状菌属（Photorhabdus），属下共有八个种。 菌株CB6是从我国本土分离的小卷蛾斯氏线虫（Steinernema carpocapsae）的共生菌，已有研究揭示其代谢产物有很好的杀虫、抑菌、抗癌等生物活性，但其分类地位尚不清楚，为了进一步开发利用此菌，本论文对该菌株开展了分类鉴定、基本发酵条件测定和诱变育种三项研究。通过测定CB6菌株的形态和生理生化特征、G+C mol％含量以及16S rRNA序列，在国内首次运用多相分类的方法对昆虫病原线虫共生菌进行系统分类，确定了菌株CB6的分类学地位，定名为Xenorhabdus nematophila CB6。同时还测定菌株在液体培养时的发酵条件以及不同的诱变方法对CB6的作用效果，以探讨高产菌株选育的可行性，为以后该菌株的诱变育种提供数据参考。现将主要研究结果总结如下： 1．菌株CB6革兰氏染色为阴性，长杆状，菌体大小为：0.5～0.9×2.1～7.3μm，周生鞭毛，不产生芽孢，不产生生物荧光，可在细胞中观察到折射性颗粒。菌株具有二型性，Ⅰ型菌在NBTA平板上可吸收染料BTB形成蓝色菌落，Ⅱ型菌不能吸收BTB。不能还原硝酸盐，H2O2酶、脲酶、磷酸酶反应为阴性，不能水解七叶苷，不能利用水杨苷、甘油产酸。对大蜡螟具有很强注射毒性，LD50仅为3—10个菌体；对多种细菌和植物病原真菌具有广谱抑菌活性。这些主要特征与嗜线虫致病杆菌（X.nematophila）种的表型特征描述基本一致。 2．采用热变性温度法测得菌株CB6的G+Cmol％含量为43.7％，而嗜线虫致病杆菌（X.nematophila）的模式菌株ATCC 19061的G+C mol％含量为43.4％，二者具有很高的相似性。 3．经PCR扩增其16S rDNA，测定16S rDNA的全序列长度为1495个碱基。利用DNAMAN 4.0软件的Multiple Sequence Alignment进行多序列同源性分析，用 摘 要 邻接法（Neighbor Joining，NJ）构建系统发育树，发现菌株 CB6在系统进化树 上和嗜线虫致病杆菌（X nematophila）种内的菌株形成一个聚类群。 综合菌株 CB6的形态及生理生化特征、ryfAI mol％含量和 165 iLNA序列 分析的结果，本研究认为菌株CB6应是X nempila种内的一个菌株，并命 名为Ah，lomaDmLsW删皿勾呐ila CB6。4．测定了菌株CB6在摇瓶培养时的基本发酵参数，结果表明抑菌活性物质的产生 和菌体的生长基本同步，在0．5％一8刀％接种量范围内对抑菌活性物质的产生 无显著影响。培养基的 pH在 6．5—7．0，通气量以 500Inl三角瓶的装量为 150llil 时，最利于抑菌活性物质的产生。5．经多种诱变因子对菌株CB6的诱变作用测试，发现其对紫外线、亚硝酸、亚硝 基肌等诱变剂均比较敏感，用紫外线照射 30秒以上、或经亚硝酸处理 10分钟 就可以对菌株造成99．9％以上致死率，用0，5％LICI和紫外线复合处理可以获 得较高的正突变率。但所筛选到的正突变菌株的遗传很不稳定，极易发生回复 突变，经连续传代三次之后，产生抑菌活性物质的水平又恢复到出发菌株。对 CB6菌株的初步诱变结果似乎说明，一般的细菌选育诱变技术不太适合该菌株 的遗传改良，改造此类共生菌菌株可能用细胞工程技术或分子生物学技术更为 适宜。 本论文对菌株CB6进行了系统的分类研究，将其命名为Xenorhabdusnem卿hila CB6，测定了该菌株的摇瓶发酵基本条件，并初步探讨了各种诱变方法对CB6的诱变效果，研究结果为今后进一步开发和利用该菌株提供基础数据。