酱油曲霉巯基氧化酶的摇瓶发酵及其性质研究

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巯基氧化酶(sulfhydryl oxidase,SOX,EC1.8.3.2)是一类由一条多肽链结合一个辅基构成的黄素蛋白。结合的辅基可以是黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或者黄素单核苷酸(FMN),它们是维生素B2的衍生物。微生物源的巯基氧化酶是一种效果良好的面粉强筋剂。本研究以从美国标准生物品保藏中心购得的酱油曲霉菌株ATCC20235为研究对象,通过单因素实验和正交设计实验的方法,对酱油曲霉摇瓶发酵产巯基氧化酶的培养基及发酵条件进行优化,获得最佳的发酵培养基为:蔗糖30 g/L、鱼粉蛋白胨6.8 g/L,K2HPO4·3H2O 2 g/L,MnCl2·4H2O 2 mg/L,BaCl2 500μg/L,H3BO3 1 mg/L,pH 8.5。用此培养基发酵生产巯基氧化酶,在30℃,220 r/min的条件下培养72 h,发酵液中酶产量可达250 U/L。酱油曲霉发酵产巯基氧化酶,过滤除菌体所得发酵液,经过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析三步纯化后,得到了电泳纯的巯基氧化酶。纯化后比酶活为75 U/mg,回收率为36 %,纯化倍数为187.5倍。酶学性质研究表明,巯基氧化酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.5,在温度不高于50℃,pH介于5-6之间时,巯基氧化酶的稳定性良好。除了Fe3+对巯基氧化酶的酶活力和稳定性有明显的抑制作用外,Ca2+、Na+、Mg2+对巯基氧化酶有激活作用,并且可以提高酶的稳定性。K+对酶的活力和稳定性基本没有影响。Ba2+、Mn2+对酶活有轻微的抑制作用,对酶的稳定性基本没有影响。巯基氧化酶的酶反应动力学常数Km=2.16 mmol/mL,Vm=526 mmol/min.mL。巯基氧化酶对面团流变学性质影响研究表明,巯基氧化酶可以大幅度提高面团稳定时间,降低弱化度,增大拉伸曲线面积和拉伸比值。当巯基氧化酶的添加量在100-150 U/kg面粉时,面团弹性大,韧性好,面筋的强度大,具有较好的发酵和烘焙特性。
摘要第3-4页
ABSTRACT第4页
目录第5-7页
1 绪论第7-12页
    1.1 面粉强筋剂的作用第7页
    1.2 化学制剂类的面粉强筋剂第7-8页
        1.2.1 溴酸钾第7-8页
        1.2.2 偶氮甲酰胺第8页
        1.2.3 抗坏血酸第8页
    1.3 酶制剂类的面粉强筋剂第8-10页
        1.3.1 戊聚糖酶第8页
        1.3.2 脂肪氧合酶第8-9页
        1.3.3 过氧化物酶第9页
        1.3.4 谷氨酰胺转氨酶第9页
        1.3.5 葡萄糖氧化酶第9页
        1.3.6 巯基氧化酶第9-10页
    1.4 本课题研究的立题依据和意义第10页
    1.5 本课题研究内容第10-12页
2 实验材料与方法第12-20页
    2.1 实验材料第12-13页
        2.1.1 菌种第12页
        2.1.2 主要试剂第12页
        2.1.3 实验仪器第12页
        2.1.4 实验用培养基和主要溶液第12-13页
    2.2 实验方法第13-20页
        2.2.1 菌种的活化第13-14页
        2.2.2 酶活测定方法第14页
        2.2.3 蛋白含量测定第14-15页
        2.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白第15-16页
        2.2.5 发酵培养基的优化方法第16-17页
        2.2.6 酶分离纯化方法第17-18页
        2.2.7 酶学性质的研究第18页
        2.2.8 面粉粉质特性和拉伸特性的测定第18-20页
3 结果与分析第20-35页
    3.1 发酵培养基优化第20-26页
        3.1.1 接种量对巯基氧化酶产量的影响第20页
        3.1.2 不同碳源对巯基氧化酶的影响第20-21页
        3.1.3 不同种类的氮源对巯基氧化酶的影响第21页
        3.1.4 蔗糖的添加量对巯基氧化酶产量的影响第21-22页
        3.1.5 氮源的添加量对巯基氧化酶产量的影响第22页
        3.1.6 磷酸盐浓度对巯基氧化酶产量的影响第22-23页
        3.1.7 金属离子对巯基氧化酶产量的影响第23页
        3.1.8 发酵培养基的初始pH 值对巯基氧化酶产量的影响第23-24页
        3.1.9 发酵温度对巯基氧化酶产量的影响第24页
        3.1.10 发酵时间对巯基氧化酶产量的影响第24-25页
        3.1.11 正交设计实验第25-26页
    3.2 巯基氧化酶的分离纯化第26-29页
        3.2.1 硫酸铵分级沉淀第26-27页
        3.2.2 离子交换柱层析第27页
        3.2.3 凝胶过滤层析第27-28页
        3.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳第28页
        3.2.5 纯化结果第28-29页
    3.3 酱油曲霉产巯基氧化酶的酶学性质研究第29-33页
        3.3.1 巯基氧化酶的最适反应温度第29页
        3.3.2 巯基氧化酶的温度稳定性第29-30页
        3.3.3 巯基氧化酶的最适反应pH第30页
        3.3.4 巯基氧化酶的pH 稳定性第30-31页
        3.3.5 金属离子对巯基氧化酶活力的影响第31页
        3.3.6 金属离子对巯基氧化酶稳定性的影响第31-32页
        3.3.7 巯基氧化酶的酶反应动力学研究第32-33页
    3.4 巯基氧化酶对面粉流变学特性的影响第33-35页
        3.4.1 对面粉粉质特性的影响第33页
        3.4.2 对面粉拉伸特性的影响第33-35页
4 主要结论与展望第35-37页
    4.1 结论第35页
    4.2 展望第35-37页
致谢第37-38页
参考文献第38-41页
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文第41页
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