TCF7L2基因多态性及RNA干扰对胰岛素原水平的影响及机制
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目的:探讨重庆地区汉族人群中TCF7L2(Transcription factor7-like2)、PCSK1(Proprotein convertase subtilisin/kexin type1)和PCSK2(Proprotein convertase subtilisin/kexin type2)的单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphisms, SNPs)和新诊2型糖尿病(Type2diabetesmellitus, T2DM)及血清胰岛素原水平的相关性。方法:采用病例-对照研究方法,研究对象包括对照组(n=152例),新诊T2DM组(n=227例)。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对TCF7L2的rs7903146和rs11196218、PCSK1的rs3811951和PCSK2的rs2021785位点进行SNPs分型。采用酶联免疫法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)测定空腹血清胰岛素原水平。统计学分析采用SAS8.1软件,遗传学分析采用在线软件完成。结果:Hardy-Weinberg平衡检验P>0.05,拟合度优良。连锁不平衡分析发现TCF7L2的rs7903146和rs11196218位点不存在连锁不平衡现象,不能构建单倍型(D’=0.348, r2=0.018)。T2DM组PCSK2的rs2021785位点次要等位基因频率(Minor allele frequency, MAF)显著低于对照组(20.04%vs26.64%, p=0.0335),在共显性模型中,该位点的基因型分布与T2DM显著相关[Odds ratio(OR)=0.627,95%CI(0.409,0.962),p=0.0308]。TCF7L2的rs7903146位点的基因型分布和I30/G30显著相关(OR=1.012,95%CI1.0001.025,P<0.05),在校正了性别、年龄和BMI后,TT和CT基因型携带者的I30/G30显著高于CC基因型携带者(P=0.0385)。T2DM组和对照组比较,TCF7L2的rs7903146和rs11196218和PCSK1的rs3811951位点的MAF和基因型分布差异均无统计学意义(P>0.05)。以上SNPs位点不同基因型携带者空腹血清胰岛素原的水平均无统计学差异(P>0.05),不同基因型携带者间胰岛素原/胰岛素比值的差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论:本研究在重庆地区的汉族人群中证实了PCSK2的rs2021785位点SNPs和T2DM显著相关,TCF7L2的rs7903146可能与早相胰岛素分泌有关,但尚未发现TCF7L2的rs7903146和rs11196218、PCSK1的rs3811951位点SNPs和T2DM的相关性,亦未发现以上SNPs位点与空腹胰岛素原及胰岛素原/胰岛素比值的相关性。目的:首先证实TCF7L2表达的转录因子在前蛋白转化酶基因的启动子上存在结合位点;其次探讨TCF7L2干扰对胰岛素原的影响及机制。方法:通过体外培养Beta-TC-6细胞株,首先采用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术证实TCF7L2表达的转录因子在前蛋白转化酶基因的启动子上存在结合位点;其次通过构建TCF7L2的慢病毒干扰载体,下调TCF7L2的表达,采用荧光定量PCR和Western Blotting方法检测TCF7L2和前蛋白转化酶基因mRNA及蛋白水平的变化,收集细胞培养液,采用ELISA方法测定基础和葡萄糖刺激状态下胰岛素和胰岛素原水平的变化;最后采用流式细胞仪检测TCF7L2干扰对胰岛β细胞凋亡的影响。结果:1. ChIP实验证实:Beta-TC-6细胞中TCF4抗体免疫沉淀的ChIP产物中能扩增到PCSK1和PCSK2基因的启动子。2. TCF7L2慢病毒干扰载体的构建及干扰效率的鉴定:酶切和测序均证实重组干扰质粒核苷酸序列插入正确,流式细胞仪测定病毒平均滴度1.2×109IU/ml。慢病毒感染Beta-TC-6细胞48小时后,在荧光显微镜下观察慢病毒感染效率达80%以上,TCF7L2干扰组TCF7L2无论是mRNA还是蛋白表达水平均显著低于对照组(P<0.05,n=3)。mRNA的干扰效率约为75%,蛋白水平的干扰率约为50%。3. TCF7L2干扰对前蛋白转化酶表达和活性的影响:①TCF7L2表达下调后,PCSK1和PCSK2基因的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P <0.05,n=3);②TCF7L2表达下调后,葡萄糖刺激的胰岛素分泌显著降低,而葡萄糖刺激后胰岛素原分泌及胰岛素原/胰岛素比值显著增加(P <0.05,n=3),提示前蛋白转化酶活性降低;③TCF7L2表达下调后,胰岛β细胞的凋亡率显著增加(P <0.05,n=5)。结论:TCF7L2表达的转录因子在前蛋白转化酶基因的启动子上存在结合位点。TCF7L2表达下调可能通过降低前蛋白转化酶基因的表达及酶的活性,进而影响胰岛素原的加工和胰岛β的功能。
英汉缩略语名词对照 | 第5-8页 |
中文摘要 | 第8-12页 |
英文摘要 | 第12-17页 |
前言 | 第18-22页 |
第一部分 TCF7L2、PCSK1和PCSK2基因多态性与2型糖尿病及胰岛素原水平的相 关性研究 | 第22-39页 |
1 对象与方法 | 第22-29页 |
2 结果 | 第29-34页 |
3 讨论 | 第34-37页 |
参考文献 | 第37-39页 |
第二部分 TCF7L2 的 RAN 干扰对胰岛素原水平的影响及机制 | 第39-82页 |
前言 | 第39-41页 |
实验一 转录因子 TCF4 在 PCSK1 和 PCSK2 基因启动子区域的结合 | 第41-50页 |
1 材料 | 第41-42页 |
2 方法 | 第42-48页 |
3 结果 | 第48-50页 |
实验二 TCF7L2 干扰慢病毒载体的构建及病毒的包装纯化 | 第50-59页 |
1 材料 | 第50-51页 |
2 方法 | 第51-56页 |
3 结果 | 第56-59页 |
实验三 TCF7L2 的 RNA 干扰对胰岛素原的影响及机制 | 第59-77页 |
1 材料 | 第59-61页 |
2 方法 | 第61-71页 |
3 结果 | 第71-77页 |
讨论 | 第77-80页 |
参考文献 | 第80-82页 |
全文总结 | 第82-83页 |
文献综述 | 第83-90页 |
参考文献 | 第88-90页 |
致谢 | 第90-91页 |
博士期间发表的论文 | 第91-93页 |
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