MAPK级联反应在共生信号传递中功能及作用机理的研究

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百脉根共生受体激酶基因SymRK是第一个被鉴定出来参与根瘤菌和菌根真菌信号转导的基因,是根瘤菌结瘤因子及菌根真菌菌根因子共生信号的交汇点,在共生信号传递过程中扮演重要的角色。本研究以SymRK为诱饵,从百脉根酵母双杂交的cDNA文库中分离到与之相互作用蛋白SIP2(SymRK-interacting protein2),SIP2是一个典型的有丝分裂原激活蛋白激酶激酶(MAPKK)。MAPK级联反应由MAPKKK、MAPKK和MAPK组成,该级联反应广泛存在于酵母、动物和植物等真核生物中,并参与各种生物或非生物的胁迫反应、激素反应、细胞分裂和发育过程的信号转导,MAPKK处于此级联的中间环节,通过磷酸化接收MAPKKK传来的信号,又通过磷酸化的方式将信号向下传递,这个级联将细胞外信号逐级放大并传导至细胞核,导致转录组的变化。本论文深入研究了MAPK级联反应在豆科植物共生信号传递过程中的作用机制和功能,其主要研究结果如下：1、共生受体激酶SymRK特异性地与MAPKK相互作用：利用酵母双杂交技术证实了百脉根MAPKK (SIP2)能与SymRK蛋白激酶结构域相互作用,不与其它的受体激酶NFR1及NFR5的蛋白激酶结构域相互作用,而百脉根MAPKK2和MAPKK10也不能与SymRK相互作用；同时,发现另一豆科植物苜蓿NORK (SymRK同系物)和SIMKK(SIP2同系物)也存在相互作用,并有交叉反应；体外pull-down进一步证实了SIP2不同区段与SymRK-PK间的互作；双分子荧光互补(BiFC)也验证了两个全长蛋白在烟草表皮细胞中的相互作用。这些结果表明SymRK与MAPKK特异性的相互作用在豆科植物中很保守,这两个蛋白在豆科植物中可能有着共同的作用机制。2、SIP2是一个有功能的蛋白激酶：SIP2编码一个丝/苏氨酸的蛋白激酶,它是否具有磷酸化和自磷酸化活性?在大肠杆菌中表达His-SIP2和GST-SIP2融合蛋白,体外磷酸化结果表明SIP2具有自磷酸化和底物水平磷酸化活性,表明SIP2是一个有功能的蛋白激酶,并且MPK6是其磷酸化底物,表明SIP2是一个典型的MAPKK;为了考察SymRK是否与SIP2互为磷酸化底物,首先将SymRK-PK和SIP2结合ATP位点进行点突变,得到SymRK-PK-KR和SIP2-KR两个磷酸化活性缺失的突变体,磷酸化结果表明SIP2不能磷酸化SymRK-PK,也不能被SymRK所磷酸化,即SymRK和SIP2不能互为磷酸化底物。3.SymRK抑制SIP2底物水平磷酸化的活性：为了进一步了解SymRK与SIP2间相互作用机制,我们在测定MPK6是SIP2磷酸化底物时,加入SymRK-PK或SymRK-PK-KR蛋白,考察SymRK对SIP2激酶活性的影响,结果表明随着SymRK-PK或SymRK-PK-KR浓度的增加,SIP2底物磷酸化活性受到抑制,并有很明显的剂量效应,在这个体系中加入NFR1-PK或BSA对SIP2磷酸化活性没有影响,表明SymRK特异性地抑制SIP2磷酸化MPK6的活性。4、SIP2在百脉根中的表达特征及亚细胞定位：鉴于SymRK在共生早期呈组成型表达,SIP2的表达是否呈现与SymRK一样的表达模式?分别收集接种和未接种根瘤菌的百脉根幼根、茎、叶、瘤等材料,利用实时荧光定量PCR检测了SIP2基因在百脉根不同组织中的表达特征,研究结果表明,在接种和未接种根瘤菌的百脉根幼根、茎、叶、瘤中,SIP2表达水平差别不大,呈组成型表达；通过发根农杆菌介导的毛根转化技术,将SIP2：：GFP融合子导入百脉根根中,在激光共聚焦显微镜下观察到SIP2：：GFP融合蛋白定位在细胞质和细胞膜,而单独的GFP蛋白在细胞质、膜与核中都有荧光信号；利用基因枪技术在洋葱表皮细胞中定位,通过质-壁分离处理后,SIP2：：GFP融合蛋白的荧光信号主要集中在细胞膜和细胞质,而GFP对照的荧光遍布整个胞质,充分证明SIP2定位在细胞膜和细胞质。5、百脉根SIP2调控根瘤菌侵染及根瘤原基的形成：为了鉴定SIP2在共生过程中的生物学功能,我们构建了两个基因沉默载体,通过毛根转化导入百脉根根中,在根瘤菌存在条件下进行盆栽试验,4周后通过荧光定量PCR测定SIP2基因的表达水平并观察植株结瘤表型,结果显示,抑制SIP2基因表达导致植株结瘤能力显著下降,侵入线和根瘤原基形成的效率显著降低；进一步分析表明SIP2-RNAi毛根中与早期根瘤菌侵染相关的3个标记基因的表达都受到不同程度的抑制,而其它两种MAPKKs的表达不受影响,这表明豆科植物SIP2参与根瘤菌早期侵染和根瘤原基的形成,在豆科植物与根瘤菌共生体形成过程中起调控作用。6、SymRK-SIP2的相互作用不影响菌根真菌与植物的共生：利用SIP2-RNAi毛根检测AM真菌的感染,结果显示RNAi-1和RNAi-2植株的毛根与转化空载体毛根对照一样都能被AM真菌感染并在细胞内形成丛枝,表明SIP2基因与菌根共生体形成无关,而是特异地调控根瘤共生体的形成。

摘要	第6-8页
Abstract	第8-10页
缩略语	第11-13页
1 前言	第13-39页
1.1 共生固氮的意义	第13页
1.2 几类微生物与植物共生系统	第13-26页
1.2.1 根瘤菌与豆科植物共生固氮体系	第14-20页
1.2.2 弗兰克氏菌与非豆科植物共生固氮体系	第20-21页
1.2.3 菌根真菌与植物共生体系	第21-24页
1.2.4 共生系统的进化	第24-26页
1.3 共生受体激酶SymRK的结构及功能	第26-32页
1.3.1 植物中的类受体激酶	第26页
1.3.2 共生受体激酶SymRK的分离	第26-27页
1.3.3 SymRK的基因结构	第27-29页
1.3.4 SymRK结构域的功能及进化	第29-30页
1.3.5 SmRK基因的功能及在植物根系共生中的作用	第30-31页
1.3.6 SymRK相互作用蛋白的研究	第31-32页
1.4 LRR-受体激酶与MAPK级联	第32-38页
1.4.1 MAPKKK	第34-35页
1.4.2 MAPKK	第35-36页
1.4.3 MAPK	第36-38页
1.5 本研究意义	第38-39页
2 实验材料与方法	第39-61页
2.1 材料	第39-45页
2.1.1 植物材料	第39页
2.1.2 菌株和质粒	第39-40页
2.1.3 培养基	第40-42页
2.1.4 缓冲液和常用反应试剂	第42-45页
2.1.5 分子生物学试剂	第45页
2.1.6 主要仪器	第45页
2.2 方法	第45-61页
2.2.1 基本分子生物学操作方法	第45-46页
2.2.2 酵母转化	第46页
2.2.3 百脉根Y2H-AD-cDNA文库的筛选	第46-48页
2.2.4 β-半乳糖苷酶活性检测	第48页
2.2.5 平板影印LacZ显色	第48-49页
2.2.6 蛋白质的纯化	第49-51页
2.2.7 Western Bloting	第51-52页
2.2.8 BiFC	第52-53页
2.2.9 蛋白激酶的自磷酸化和底物磷酸化检测	第53页
2.2.10 植物材料的准备	第53-55页
2.2.11 植物总RNA的提取	第55-56页
2.2.12 Real-time PCR的反应	第56-57页
2.2.13 基因枪的使用	第57-58页
2.2.14 异源蛋白在植物细胞中的瞬间表达及检测	第58页
2.2.15 异源蛋白在烟草内的表达及检测	第58-59页
2.2.16 发根农杆菌介导百脉根遗传转化(毛根转化)体系的建立	第59页
2.2.17 毛根再生植株体系的建立	第59-60页
2.2.18 结瘤实验	第60页
2.2.19 侵入线的观察	第60页
2.2.20 AM真菌侵染率的测定	第60-61页
3 结果与分析	第61-92页
3.1 SymRK相互作用的靶蛋白的筛选	第61-62页
3.2 SIP2基因的相关研究	第62-92页
3.2.1 SIP2基因的结构	第62-66页
3.2.2 SIP2蛋白与SymRK蛋白的相互作用	第66-73页
3.2.3 SIP2蛋白的体外磷酸化活性	第73-77页
3.2.4 SIP2在百脉根中的表达和亚细胞定位	第77-79页
3.2.5 SIP2基因在百脉根中的超量表达	第79-84页
3.2.6 百脉根中SIP2的基因沉默	第84-92页
4 总结与讨论	第92-98页
4.1 总结	第92-93页
4.2 讨论	第93-97页
4.2.1 LysM-RLK→Rop→MAPK级联	第93-94页
4.2.2 SymRK和MAPK级联	第94-95页
4.2.3 结瘤因子共生信号和其它信号协同调控	第95-97页
4.3 展望	第97-98页
参考文献	第98-109页
附录一：本实验所用引物	第109-111页
附录二：本实验提交的序列	第111-114页
附录三：论文发表情况	第114页

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论文编号ABS548590，这篇论文共114页

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