基于基因工程多肽(genetically engineered polypeptide)的水凝胶(hydrogel)作为一种新型的生物材料,具有优越的生物相容性和结构可调性,在生物医学领域中展现出广阔的应用前景。本论文主要包括多肽水凝胶的制备及作为支架材料用于三维(3 D)细胞培养和组织工程的研究；多肽微凝胶的制备及组装构建多孔水凝胶用于组织工程的研究；多肽PC10A(RGD)(P和A均为具有螺旋卷曲结构的序列,C10是一段无序的水溶性序列,RGD是精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成的三肽序列)一荧光量子点(QDs)杂化纳米水凝胶的制备及用于靶向生物成像的研究；不同电荷的多肽分子作为表面配体用于QDs的修饰及其靶向生物成像的研究。具体工作如下：(1)设计并合成了一种基于卷曲螺旋多肽P和聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)的光聚合物理水凝胶,作为支架材料用于3D细胞培养和组织工程的研究。多肽Pcys或RGDPcys与PEGDA通过迈克尔加成(michael加成)反应偶联构建光敏高分子单体P-PEG-acrylate/RGDP-PEG-acrylate。该单体在光引发剂I-2959和UV作用下形成光聚合物理水凝胶。水凝胶变性实验及流变检测结果均验证该类水凝胶为物理水凝胶。流变结果还表明该水凝胶具有较高的机械强度和可调谐性的弹性模量。该水凝胶还具有优良的溶胀性能和稳定性,如10%(w/v)水凝胶的溶胀率和稳定性分别是38%和15 d。愈合实验显示该物理水凝胶具有良好的自愈合特性,该特性可用于驱动介导微凝胶间的自组装。细胞毒性实验显示该水凝胶材料具有优越的生物相容性。细胞二维(2 D)表面生长实验表明多肽水凝胶材料可以通过改变多肽成分(如引入细胞整合素RGD)来调节水凝胶表面对细胞的粘附性能。3 D细胞培养实验结果显示,细胞可以在该物理水凝胶内保持较高的细胞活性,且在26 h之后可以自由伸展和迁移。这些实验结果都为多肽水凝胶在组织工程中的应用提供理论基础。(2)利用多肽物理水凝胶自愈合特性,以自下而上(bottom-up)的方式组装负载有细胞(cell-laden)的微凝胶(microgel)构建多孔水凝胶,并应用于组织工程研究。在(1)的基础上,合成光聚合物理微凝胶及cell-laden微凝胶。微凝胶表面多肽P间的动态自组装驱动介导微凝胶的组装构建多孔水凝胶。微凝胶的尺寸与形状可以通过光掩模调节控制,微凝胶的高度通过spacer(垫片)的高度来调控。此外,该微凝胶可以通过bottom-up和层层组装的形式进行组装。对比组装水凝胶和非组装水凝胶结构,发现组装水凝胶内的空隙大小与空隙连接性都远优于非组装水凝胶。组装水凝胶的多孔性非常适合营养成分及氧气的输送和代谢产物的排出,确保胶内深层细胞的高活性。3D细胞培养实验显示,细胞在微凝胶合成以及组装之后都能保持较高活性,并且在组装24 h后可以自由伸展。实验表明这种微凝胶的合成材料、合成方法及组装方法非常适合用于模拟构建“组织结构”。(3)PC1oA多肽纳米水凝胶(nanogel)作为载体包裹修饰疏水性荧光QDs,并应用于靶向生物成像研究。用“热变性-复性”方法处理低浓度多肽PC1oA水溶液制备PC1oA纳米水凝胶颗粒。透射电镜(TEM)结果显示,纳米水凝胶的尺寸可以通过多肽浓度来调控,尺寸范围从20nm到300nm。TEM和EDXS(能谱仪)实验结果表明,疏水性QDs可以均匀分散到纳米水凝胶内部,而且纳米水凝胶内的QDs负载量也具有可调性,但其具有一定饱和度。动态光散射分析显示纳米水凝胶具有良好的稳定性(大于20d),且在负载疏水性的QDs后,纳米水凝胶的稳定性稍有增加。荧光光谱分析表明,疏水性QDs被纳米水凝胶包裹转水之后,仍具有很好的荧光强度(量子产率QY=33.5%),且荧光强度随着pH值的增加而增强。MTT结果表明,单独的PC10ARGD纳米水凝胶对细胞无毒性,负载有适量疏水性QDs的PC10ARGD-QDs仍具有较好的细胞生物相容性,但是当QDs浓度超过PC10ARGD纳米水凝胶的负载范围时,PC10ARGD-QDs表现出较高的细胞毒性。激光扫描共聚焦成像表明,多肽纳米水凝胶PC10ARGD可赋予疏水性QDs良好的靶向性。因此,此种纳米水凝胶适合作为载体用于包裹修饰疏水性纳米颗粒,并赋予它们良好的生物相容性、水相稳定性和靶向性等特性,在细胞靶向成像领域内具有较大的应用潜能。(4)利用不同电荷的多肽分子修饰水溶性QDs用于肿瘤细胞的靶向生物标记。利用多肽A(带负电荷)、B(带正电荷)、ARGD和BRGD作为表面配体修饰CdSe@ZnS构建探针QD-A,QD-B,QD-BA(近中性电荷),QD-ARGD和QD-BRGD。琼脂糖凝胶电泳、粒径和zeta电位实验都证明不同电荷的荧光探针已被成功构建。而且,QD-polypeptide的粒径和zeta电位可以通过修饰不同的多肽来调控。毛细管电泳(CE)实验结果表明,此类多肽与QDs的饱和摩尔比例为30：1。荧光光谱分析结果表明多肽的修饰对QDs具有荧光增强效应,大约增强2-3倍,且与电荷无明显关联。MTT结果显示,单独的多肽及QD-polypeptide均无急性细胞毒性,但QD-ARGD具有一定的慢性细胞毒性。因此,这类探针更适合短时程细胞荧光成像。激光扫描共聚焦成像结果表明,正电荷多肽B能够促进细胞对探针的非特异性摄取,负电荷多肽A能够抑制细胞对探针的非特异性摄取,负电荷与靶向分子在探针的细胞靶向摄入过程中具有协同效应,同时含有负电荷和靶向分子的多肽ARGD能够有效提高细胞对探针的特异性靶向摄入。流式细胞仪实验结果与激光扫描共聚焦成像结果一致。实验结果表明,QD-ARGD探针具有高特异性细胞摄取、高荧光强度及低背景噪声的优点,在细胞靶向生物成像中具有很大的应用潜能。
