细胞自噬及其microRNAs调控分子的筛选与验证
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背景与目的自噬是细胞成份的自我降解过程,它是存在于真核细胞中一种普遍的生命现象。自噬可以实现细胞内环境稳态,并且与多种疾病的发生发展具有密切的关系。microRNAs是一类由DNA转录产生,不翻译成蛋白质的小调控RNA。它通过与靶mRNA的序列互补,以降解靶mRNA或抑制其翻译。近来研究表明microRNAs参与生物体的一系列生物过程,而且microRNAs在癌症、神经退行性疾病、感染、衰老、心脏病等多种疾病的发生发展过程中起着重要的作用。最近已有报道,microRNAs可以调控自噬过程中自噬相关蛋白的表达。本研究通过系列生物信息学方法,筛选对自噬过程有潜在调控作用的microRNAs,并通过相关生物学实验进行验证。同时利用回转器模拟微重力效应,探究神经细胞自噬与微重力之间的关联性。方法利用生物信息学方法预测出可能参与自噬调控的microRNAs。利用雷帕霉素分别诱导乳腺癌细胞MCF7、卵巢癌细胞SKOV-3 12h以使细胞产生自噬。microRNAs模拟物或microRNAs抑制剂转染细胞,此时microRNAs过表达或低表达,然后观察细胞中微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达水平。回转模拟微重力的细胞学效应,回转条件下培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 12h、24h,相同条件下静止培养的细胞作为对照组。Western Blotting方法检测LC3蛋白表达水平。荧光显微镜观察绿色荧光标记的LC3(GFP-LC3)点状聚集物变化。结果(1)建立自噬诱导的模型:雷帕霉素处理细胞12h以诱导自噬,雷帕霉素组中GFP-LC3点状聚集物多于对照组分别体现在MCF7细胞(P < 0.05)和SKOV-3细胞(P< 0.001)中。MCF7细胞中雷帕霉素+氯化铵组GFP-LC3点状聚集物显然高于其余各组(P < 0.01)。Western Blotting检测MCF7细胞和SKOV-3细胞中LC3蛋白表达水平,与对照组相比,雷帕霉素组皆显示LC-II表达升高。MCF7细胞中雷帕霉素+氯化铵组LC3-II表达增多更为显著。(2)筛选出与自噬相关的microRNAs为miR-142-5p,经生物实验验证miR-142-5p对雷帕霉素诱导的MCF7细胞自噬中LC3表达无明显影响;(3)筛选与卵巢癌细胞自噬有关的4个microRNAs中,其中一个microRNA在雷帕霉素诱导SKOV-3细胞情况下,瞬时转染microRNAs模拟物或microRNAs抑制剂,Western Blotting结果中microRNAs模拟物可降低LC3蛋白的表达水平,反之,microRNAs抑制剂可使LC3蛋白表达水平升高。荧光显微镜下观察到,microRNAs模拟物使细胞中GFP-LC3点状聚集物减少,而microRNA抑制剂物却增加了GFP-LC3点状聚集物的聚集。而且其余3个microRNAs模拟物对SKOV-3细胞中LC3表达无显著变化;(4)Western Blotting结果显示SH-SY5Y细胞的LC3-II蛋白表达回转组高于对照组回转+氯化铵组显著高于回转组和对照组,荧光显微镜下观察到GFP-LC3点状聚集物随之增多。结论雷帕霉素可以诱导SKOV-3细胞和MCF7细胞产生自噬效应,miR-142-5p对MCF7细胞的自噬无明显作用。而筛选出的与卵巢癌细胞自噬有关的4个microRNAs中亦有一个microRNAs对SKOV-3细胞自噬有影响,其余3个microRNAs对SKOV-3细胞自噬无统计学意义。自噬相关microRNAs分子的筛选鉴定,可以促进自噬分子机制的认识。模拟微重力可诱导SH-SY5Y细胞中自噬体增多,故自噬对神经细胞产生的影响可能为航天医学的研究提供一个新的线索。
摘要 | 第4-6页 |
Abstract | 第6-8页 |
1 绪论 | 第12-16页 |
1.1 本论文研究背景和研究现状 | 第12-14页 |
1.2 研究目的及意义 | 第14-15页 |
1.2.1 研究目的 | 第14页 |
1.2.2 理论意义 | 第14-15页 |
1.3 研究内容 | 第15-16页 |
2 自噬与 microRNAs 之间的相关性联系 | 第16-38页 |
2.1 自噬 | 第16-30页 |
2.1.1 自噬的发现及概述 | 第16-17页 |
2.1.2 自噬的分类 | 第17-18页 |
2.1.3 自噬相关基因 Atg | 第18-22页 |
2.1.4 自噬与细胞死亡 | 第22-24页 |
2.1.5 自噬与信号调控通路 | 第24-26页 |
2.1.6 自噬的检测方法 | 第26-29页 |
2.1.7 自噬在病理生理过程中的作用 | 第29-30页 |
2.2 microRNAs | 第30-37页 |
2.2.1 microRNAs 的概述 | 第30页 |
2.2.2 microRNAs 的形成及作用机制 | 第30-32页 |
2.2.3 microRNAs 的生理病理作用 | 第32-37页 |
2.3 microRNAs 与自噬之间的联系 | 第37-38页 |
3 自噬模型的建立 | 第38-51页 |
3.1 材料 | 第38-41页 |
3.1.1 实验细胞 | 第38页 |
3.1.2 主要试剂 | 第38-39页 |
3.1.3 主要试剂的配制 | 第39-40页 |
3.1.4 实验仪器 | 第40-41页 |
3.2 实验方法 | 第41-47页 |
3.2.1 细胞的复苏、培养及传代 | 第41-42页 |
3.2.2 雷帕霉素(Rapamycin)诱导细胞的自噬 | 第42页 |
3.2.3 细胞总蛋白提取 | 第42页 |
3.2.4 蛋白浓度的测定 | 第42-43页 |
3.2.5 蛋白印迹法(Western Blotting)检测样品中的蛋白含量 | 第43-44页 |
3.2.6 GFP-LC3 质粒扩增 | 第44-46页 |
3.2.7 GFP-LC3 质粒琼脂糖凝胶电泳 | 第46页 |
3.2.8 GFP-LC3 质粒转染细胞 | 第46-47页 |
3.2.9 数据统计分析 | 第47页 |
3.3 结果 | 第47-50页 |
3.3.1 人类乳腺癌细胞 MCF7 自噬模型的建立 | 第47-49页 |
3.3.2 人类卵巢癌细胞 SKOV-3 自噬模型的建立 | 第49-50页 |
3.4 讨论 | 第50-51页 |
4 microRNAs 对自噬的影响 | 第51-59页 |
4.1 材料 | 第51-52页 |
4.1.1 实验细胞 | 第51页 |
4.1.2 主要试剂 | 第51-52页 |
4.1.3 主要试剂的配制 | 第52页 |
4.1.4 实验仪器 | 第52页 |
4.2 实验方法 | 第52-54页 |
4.2.1 miRNA-142-5p mimics 转染 MCF7 细胞 | 第52页 |
4.2.2 miRNAs mimics 或 miRNAs inhibitor 转染 SKOV-3 细胞 | 第52-53页 |
4.2.3 GFP-LC3 质粒和 microRNAs 共转染 SKOV-3 细胞 | 第53页 |
4.2.4 基于生物信息学软件手段筛选与自噬有关的 microRNAs | 第53-54页 |
4.2 5 基于本课题组研发的生物信息学方法筛选与卵巢癌自噬有关的microRNAs | 第54页 |
4.2.6 数据统计分析 | 第54页 |
4.3 结果 | 第54-57页 |
4.3.1 miR-142-5p 对 MCF7 细胞 LC3 蛋白表达的影响 | 第54-55页 |
4.3.2 miRNAs 对自噬的影响 | 第55-57页 |
4.4 讨论 | 第57-59页 |
5 模拟微重力效应对神经细胞自噬的影响 | 第59-65页 |
5.1 材料 | 第59-60页 |
5.1.1 实验细胞 | 第59页 |
5.1.2 主要试剂 | 第59页 |
5.1.3 主要试剂的配制 | 第59页 |
5.1.4 实验仪器 | 第59-60页 |
5.2 实验方法 | 第60页 |
5.2.1 细胞培养 | 第60页 |
5.2.2 利用回转器模拟微重力 | 第60页 |
5.2.3 数据统计分析 | 第60页 |
5.3 结果 | 第60-63页 |
5.3.1 回转对 GFP-LC3 点状聚集物的影响 | 第60-62页 |
5.3.2 回转对 LC3 蛋白表达的影响 | 第62-63页 |
5.4 讨论 | 第63-65页 |
6 结论与展望 | 第65-66页 |
参考文献 | 第66-79页 |
攻读硕士学位期间所取得的研究成果 | 第79-80页 |
致谢 | 第80页 |
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