目的:应用等位基因特异性PCR技术和基因测序技术研究真性红细胞增多症（PV）中JAK2 V617F基因突变的发生率及其临床意义。方法:①研究对象:将112例恶性血液疾病患者分为三组。20例PV患者为PV组,其中男13例、女7例,年龄36-66岁。20例原发性血小板增多症（ET）、6例特发性骨髓纤维化（IMF）共26例作为其他MPD组进行检测。66例其他恶性血液疾病列为对照组,包括31例急性髓系白血病（AML）、13例急性淋巴细胞白血病（ALL）、17例慢性粒细胞白血病（CML）、和5例慢性淋巴细胞白血病（CLL）。另将5名健康正常人作为正常对照。PV的诊断标准参照PVSG和WHO制定的标准。②基因组DNA的制备:抽取患者外周血5 ml,常规分离白细胞,用QIAamp DNA mini kit按说明提取白细胞基因组DNA。基因组DNA的终浓度为100-200μg/ml。③PCR引物设计和PCR扩增:根据JAK2 V617F突变所在的第12外显子共设计三条引物,即上游的外侧引物和特异引物两条、下游的一条通用引物。外侧引物扩增片断为364bp,作为内对照,其引物为5’-ATCTATAGTCATGCTGAAAGAGGAGAAAG-3’;特异引物扩增片断长度203 bp,该引物跨越JAK2 V617F（G→T）的突变位点,其3’端的倒数第三位碱基错配设计,以扩增具有JAK2 V617F突变的标本,该特异引物为5’-AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3’;下游的通用引物为5’-CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTCA-3’。反应体系为10×缓冲液2.5μl,引物（20μmol/L）1.6μl （包括外侧引物和特异引物、下游通用引物）,10mmol/L dNTPs 0.5μl, 25mmol/L MgCl21.4μl, Taq DNA聚合酶0.25μl,DNA模板25 ng,加去离子水至终体积25μl。反应程序为:应用Touch-Down程序,94℃预变性5 min ,94℃变性30s,65-56℃退火40s,72℃延伸30s,10个循环;94℃变性30s,58℃退火40s,72oC延伸30s,33个循环;最后72℃延伸7 min。④琼脂糖凝胶电泳:产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后紫外光透视仪分析图像并照相。⑤基因测序:对阳性标本和随机抽取的10例阴性标本,再次分别在与上述相同的反应体系和程序条件下,以外侧引物进行PCR反应。PCR扩增产物经过纯化后,由上海生工生物公司进行测序。将所得到的测序结果与野生型基因序列进行对比。⑥统计学处理:应用SPSS（10.0）统计软件包进行统计学分析。结果:①JAK2 V617F突变检测情况:等位基因特异性PCR检测发现JAK2 V617F突变阳性标本有203bp和364bp两条条带,而阴性标本只有一条364bp条带。20例PV中有14例存在JAK2 V617F突变（70.0%）;40%的ET和33.3%IMF患者JAK2 V617F呈阳性。而AML、ALL、CML和CLL患者均未检测到JAK2 V617F突变现象。5例正常人也为阴性。PV组与对照组比较, P<0.001,而PV组与其他BCR/ABL阴性MPD组比较, P<0.05。②基因测序:等位基因特异性PCR检测所发现的阳性标本和所有的阴性标本进行基因测序。基因测序结果与等位基因特异性PCR检测相一致。③JAK2 V617F突变阳性与阴性PV的临床特征:将20例PV病例根据JAK2 V617F突变发生情况进一步分为JAK2 V617F阳性PV和JAK2 V617F阴性PV两个亚组。JAK2 V617F阳性组男10例、女4例,年龄36-66岁（平均57.6岁）, Hb为179.0g/L-217.0 g/L （平均191.4 g/L） , WBC为5.9×109/L -22.6×109/L （平均13.2×109/L）, BPC为153.0×109/L -787.0×109/L （平均297.5×109/L） ,Hct为51.0%-67.0%（平均59.1%）。JAK2 V617F阴性组男3例、女3例,年龄42-70岁（平均55.8岁）,Hb为185.0g/L-225.0g/L （平均199.3 g/L）, WBC为8.0×109/L -14.9×109/L （平均10.3×109/L） ,BPC为163.0×109/L- 246.0×109/L （平均209.7×109/L）,Hct为56.0%-70.0%（平均61.7%）。JAK2 V617F阳性PV组脾肿大4例和肝肿大1例、阴性组脾肿大3例、无肝肿大病例,两组所有病例骨髓检查都是三系增生活跃。JAK2 V617F阳性和阴性病人的年龄、性别、外周血象、骨髓检查和肝脾肿大等临床生物学检查结果均无显著差异（两组比较均为P>0.05）。④JAK2 V617F阳性ET患者的Hb和WBC明显高于阴性患者,羟基脲的治疗效果较好,临床特征与PV患者相似;而JAK2 V617F阴性ET患者则以单纯BPC升高为主。结论:PV患者中JAK2 V617F突变高达70%（14/20例）,高于其他MPD（ET和IMF）中的阳性率;而在AML、ALL、CLL、MDS等疾病中均阴性。因此,JAK2 V617F突变是PV患者的特征性标志,可以作为PV的诊断指标。JAK2 V617F阳性与阴性患者之间的临床生物学特征方面则无明显的差异。
