细菌性败血症是银鲫的主要病害之一,此病流行时间长、流行地域广、危害性大,给银鲫养殖户带来了巨大的经济损失。本研究于2009年5月至2010年10月间对射阳盐场地区银鲫细菌性败血症的流行情况进行了调查,并对病原菌进行了分离鉴定,通过分子生物学方法对其进行基因分型,研究其与菌株致病能力及抗原性的关系,以期为银鲫细菌性败血症防控措施的制定奠定基础。本研究主要分为以下4个部分。1射阳盐场地区银鲫细菌性败血症流行病学调查及病原菌分离鉴定2009年5月-2010年10月对射阳地区银鲫细菌性败血症于20℃-34℃开始流行,29℃-33℃为发病高峰,主要危害0.2-0.4kg的当年鱼种及成鱼,分慢性型与急性型两种发病类型,水体中水温、溶氧的变化及较高的亚硝酸盐含量会使疾病病情恶化;从自然患病鱼体上共分离了17株病原菌,鉴定均为致病性嗜水气单胞菌; 17株病原菌生化表型、致病性间存在差异。17株病原菌耐药性严重,对阿莫西林、多西环素、氟苯尼考、土霉素等药物完全耐药;对左氟沙星、恩诺沙星、罗红霉素、新霉素、庆大霉素、复方新诺明、磺胺二甲嘧啶、多粘菌素等药物不同程度耐药。2鲫源嗜水气单胞菌的ERIC-PCR分型方法建立及应用本实验建立了一套嗜水气单胞菌ERIC-PCR分子分型方法,并对PCR体系、反应条件等关键点进行了优化,该方法稳定性好、可有效区分菌株遗传学背景的差异,适用于嗜水气单胞菌分子流行病学研究;用所建立的方法对2009-2010年射阳地区分离的17株致病性嗜水气单胞菌分离株及7株本实验室保藏的分离与其他地区的嗜水气单胞菌进行检测发现,24株鲫源嗜水气单胞菌可聚为3类,分别用A、B、C型表示。其中14株射阳地区分离株与江西株S2、浙江株BSK-10、广东株S3及80916同为B型,其余3株分离株基因型与浙江株H-1同为A型,说明射阳地区与这些地区可能存有致病性嗜水气单胞菌输出或输入现象;本研究还发现,从同一病例中分离的多株致病性嗜水气单胞菌株基因型存在差异,从同一发病池塘不同时间发病病例中分离的致病性嗜水气单胞菌株基因型间存在差异。3鲫源嗜水气单胞菌毒力因子分布及其与基因型的关系本实验建立了一套致病性嗜水气单胞菌5个主要毒力基因多重PCR检测方法,并对PCR体系、反应条件等关键点进行了优化,该方法特异性强、敏感性高、反应结果清晰且易判断,适用于大量样本的快速检测。用所建立的方法对2009-2010年射阳地区分离的17株致病性嗜水气单胞菌进行检测发现,不同菌株间5种毒力基因的携带情况存有差异,毒力基因型为aer+hly+alt+ahp+act+的菌株最多。此外,本研究发现菌株致病力与菌株毒力基因携带情况存在联系,毒力基因组成为aer + hly + alt +ahp +act+菌株毒力高于毒力基因缺失株,可能是急性型细菌性败血症的致病株,而毒力缺失株可能会导致慢性型的细菌性败血症;17株鲫源致病性嗜水气单胞菌分离株的致病力及毒力基因携带情况与ERIC-PCR基因型存有一定的关系,毒力基因型aer+hly+alt+ahp+act+的嗜水气单胞菌分离株ERIC-PCR基因型均为B型具有急性毒性,ERIC-PCR基因型为A型的嗜水气单胞菌分离株的5个毒力基因均有不同程度的缺失,毒性较弱。这表明B型嗜水气单胞菌多可能为强毒株,有必要加强对此类菌株的监测及防控,避免此类强毒株在大范围内流行。4鲫源嗜水气单胞菌抗原性及其与基因型的关系本实验通过研究17株鲫源嗜水气单胞菌的ERIC-PCR基因型与免疫原性进行研究,发现各菌株对同种基因型菌株交叉凝集效价显著高于对不同基因型间菌株的交叉凝集效价,说明ERIC-PCR基因型与菌株免疫原性间存一定关系,ERIC-PCR方法经标准化后可以传统克服血清分型法受到标准菌株限制、存在大量不可分型株、实验室间难以比较等缺点,成为嗜水气单胞菌疫苗株的筛选分析的新途径,为嗜水气单胞菌多价疫苗、亚单位疫苗的开发及疫苗预期效果评价奠定基础。
