粤蓝链霉菌主要次级代谢产物分析及其生物合成基因簇的克隆与功能研究

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粤蓝链霉菌(Streptomyces vietnamensis)GIMV4.0001是本研究室近年从热带原始森林土壤中分离获得的一株链霉菌新种。前期研究发现该菌株能产生色调优美的紫罗兰蓝色素。本研究对该菌的产色发酵条件进行了优化,发现高氏合成一号培养基是适合的产色培养基,该培养基原料价格低廉,可作为工业化生产的基础培养基;优化的培养参数组合为:接种量5%,培养温度30℃,180rpm振动培养7d。对该菌产生的次级代谢产物进行了系统的研究,发现其发酵产物对革兰氏阳性细菌有较强的广谱抗菌活性,对部分革兰氏阴性菌也有不同程度的抑制作用,同时对HeLa肿瘤细胞也显现出很强的抑制作用;薄层层析–生物显影发现2个蓝色组分B1、B2是主要的抗菌活性成分,通过质谱、核磁共振等波谱分析,两个蓝色化合物分别被鉴定为榴菌素和榴菌素B。从发酵产物中还分离、鉴定了其它5个相关化合物,分别为醌茜兰类色素Zg、Zgg、二氢Zg、MM44785和去鼠李糖基MM44785,其中二氢Zg和去鼠李糖基MM44785是两个新的榴菌素相关化合物注1。对粤蓝链霉菌次级代谢产物生物合成途径的多样性进行了分析,发现该菌除榴菌素生物合成途径外,还可能存在合成大环内酯类、角环类化合物以及孢子色素等多条PKS途径,为深入挖掘该菌可能存在的其它生物活性物质提供了指导。采用分段、分步的策略,克隆测序了包含粤蓝链霉菌榴菌素完整生物合成基因簇的序列37480bp;发现粤蓝链霉菌榴菌素生物合成基因数目、基因排列等与紫红链霉菌(S. violaceoruber)Tü22的榴菌素生物合成基因簇完全相同,但序列长度与要短1260bp,整个基因簇中存在大约100个小片段的插入或缺失,提示插入或缺失小片段可能是链霉菌基因组进化的基本机制之一。粤蓝链霉菌与紫红链霉菌的榴菌素生物合成基因簇总体上同源率较高,提示二者具有较近的共同祖先;然而基于16S rDNA序列的链霉菌属系统进化发育树分析发现,粤蓝链霉菌与紫红链霉菌存在相对较远的亲缘关系,已知的榴菌素产生菌在链霉菌属中也呈离散分布,因此,榴菌素生物合成基因簇在链霉菌属内可能发生了水平转移,为抗生素生物合成基因簇存在水平转移的观点提供了有力的证据;侧翼基因orf35在粤蓝链霉菌中的缺失和orf35基因3个碎片的发现,呈现出了榴菌素生物合成基因簇在水平转移之后进一步进化的一个情景,目前存在于粤蓝链霉菌基因组中的榴菌素生物合成基因簇可被诠释为基因水平转移和垂直变异的共同结果。随后分析了粤蓝链霉菌对常用抗生素的天然抗性水平,发现粤蓝链霉菌对阿普拉霉素、卡那霉素、链霉素、壮观霉素、硫链丝菌素等均可用作粤蓝链霉菌遗传操的抗性标记,并通过大肠杆菌–粤蓝链霉菌属间接合转移的方法成功建立了粤蓝链霉菌的遗传转化体系。以衍自pCR2.1的重组质粒替代基因组文库cosmid作为突变模板质粒,尝试将PCR targeting系统应用于粤蓝链霉菌,以阿普拉霉素抗性基因片段置换榴菌素生物合成的关键基因orf1、orf2、orf3,成功构建了不产榴菌素的突变株,这是首次成功建立榴菌素产生菌的有效遗传改造体系,为深入了解榴菌素生物合成及其调控机制奠定了基础。通过体外重组表达和体内基因敲除等方法对榴菌素生物合成基因orf20进行了功能研究,发现携带表达orf20重组质粒的大肠杆菌对百草枯的抗性显著提高,而敲除orf20基因后的粤蓝链霉菌突变株对百草枯的抗性水平没有发生显著变化,但其色素产量(榴菌素)大幅提高,是野生株的3.3倍。这说明ORF20能够替代大肠杆菌SoxR参与抗氧化胁迫的调控,但在原宿主粤蓝链霉菌中并不参与抗氧化胁迫调控,而是对榴菌素的生物合成存在负调控效应。对榴菌素外排基因orf15在粤蓝链霉菌中的转录表达规律进行了分析,发现在野生株开始产色前orf15转录表达水平突然升高,产色后迅速降低;在敲除orf20基因后的突变株中,orf15的转录表达水平在产色前也突然升高,但与野生株相比,提高的幅度要大、高水平转录持续的时间也要长。这是orf20突变株榴菌素的产量要比野生株高的原因。
摘要第5-7页
Abstract第7-8页
缩写词及主要符号表第14-17页
第一章 绪论第17-44页
    1.1 链霉菌简介第17-18页
    1.2 次级代谢产物的合成途径第18-22页
        1.2.1 聚酮合酶途径第19-21页
            1.2.1.1 I型PKS第19页
            1.2.1.2 II型PKS第19-21页
            1.2.1.3 III型PKS第21页
        1.2.2 非核糖体多肽合成酶途径第21-22页
    1.3 抗生素生物合成的调控第22-24页
        1.3.1 途径特异性调控第22页
        1.3.2 多效性调控第22-24页
    1.4 榴菌素研究进展第24-36页
        1.4.1 榴菌素的性质、结构和活性第24-27页
        1.4.2 榴菌素的成药性第27-28页
        1.4.3 榴菌素的生物合成第28-36页
    1.5 转录因子SoxR的结构、调控机制及生理功能第36-42页
        1.5.1 SoxR的结构第36-37页
        1.5.2 SoxR的调控机制第37-40页
            1.5.2.1 SoxR的激活及其感应的信号分子第37-39页
            1.5.2.2 SoxR的调控模式第39-40页
        1.5.3 SoxR的生理功能第40-42页
            1.5.3.1 抗氧化胁迫第40页
            1.5.3.2 抗生素抗性第40-41页
            1.5.3.3 致病性第41页
            1.5.3.4 群体感应第41-42页
            1.5.3.5 其它生理功能第42页
    1.6 本论文的研究意义第42-44页
第二章 粤蓝链霉菌主要次级代谢产物的生物活性及化学分析第44-57页
    2.1 引言第44页
    2.2 实验设备和材料第44-46页
        2.2.1 主要仪器第44页
        2.2.2 试验菌株和细胞第44-45页
        2.2.3 主要试剂第45页
        2.2.4 培养基和溶液配方第45-46页
    2.3 实验方法第46-48页
        2.3.1 产色培养基的选择及发酵条件优化第46页
        2.3.2 发酵产物的提取第46页
        2.3.3 抗菌活性测定第46页
        2.3.4 TLC-生物显影第46-47页
        2.3.5 抗肿瘤活性测定第47页
        2.3.6 发酵产物的分离和结构鉴定第47-48页
    2.4 结果与讨论第48-55页
        2.4.1 产色培养基的选择及发酵条件优化第48-50页
        2.4.2 发酵产物的抗菌活性第50-51页
        2.4.3 发酵产物的抗肿瘤活性第51页
        2.4.4 发酵产物的分离和结构鉴定第51-55页
    2.5 本章小结第55-57页
第三章 粤蓝链霉菌次级代谢产物生物合成途径的多样性分析第57-69页
    3.1 引言第57页
    3.2 实验设备和材料第57-59页
        3.2.1 主要仪器第57页
        3.2.2 试验菌株第57页
        3.2.3 主要试剂第57-58页
        3.2.4 培养基和溶液配方第58-59页
    3.3 实验方法第59-63页
        3.3.1 链霉菌的培养和保存第59页
        3.3.2 链霉菌基因组DNA提取第59-60页
        3.3.3 引物设计及PCR扩增第60-61页
        3.3.4 PCR产物回收第61页
        3.3.5 大肠杆菌感受态细胞制备第61-62页
        3.3.6 DNA的连接第62页
        3.3.7 重组质粒的转化及筛选第62页
        3.3.8 大肠杆菌质粒的提取第62-63页
        3.3.9 重组质粒的鉴定第63页
        3.3.10 序列测定和分析第63页
    3.4 结果与讨论第63-68页
        3.4.1 粤蓝链霉菌I型PKS途径的检测及分析第63-65页
        3.4.2 粤蓝链霉菌II型PKS途径的检测及分析第65-68页
        3.4.3 粤蓝链霉菌NRPS途径的检测及分析第68页
    3.5 本章小结第68-69页
第四章 榴菌素基因簇的克隆与分析第69-80页
    4.1 引言第69页
    4.2 实验设备和材料第69页
        4.2.1 主要仪器第69页
        4.2.2 试验菌株第69页
        4.2.3 主要试剂第69页
        4.2.4 培养基和溶液配方第69页
    4.3 实验方法第69-72页
        4.3.1 引物设计第69-71页
        4.3.2 榴菌素生物合成基因簇的克隆测序第71页
        4.3.3 序列及进化树分析第71-72页
    4.4 结果与讨论第72-79页
        4.4.1 粤蓝链霉菌榴菌素基因簇的克隆第72-75页
        4.4.2 粤蓝链霉菌榴菌素基因簇的序列分析第75-79页
    4.5 本章小结第79-80页
第五章 粤蓝链霉菌遗传转化体系的建立第80-93页
    5.1 引言第80页
    5.2 实验设备和材料第80-82页
        5.2.1 主要仪器第80页
        5.2.2 主要试剂第80-81页
        5.2.3 试验菌株和质粒第81页
        5.2.4 培养基和溶液配方第81-82页
    5.3 实验方法第82-85页
        5.3.1 微生物的培养第82页
        5.3.2 链霉菌孢子悬液的制备第82页
        5.3.3 抗生素敏感性测定第82页
        5.3.4 引物设计第82-83页
        5.3.5 质粒从大肠杆菌向链霉菌的接合转移第83页
        5.3.6 接合转移子的筛选和验证第83-84页
        5.3.7 链霉菌质粒 DNA 的提取第84页
        5.3.8 PCR targeting 系统中大肠杆菌电转化感受态制备及电转化第84-85页
    5.4 结果与讨论第85-91页
        5.4.1 粤蓝链霉菌天然抗性水平第85-86页
        5.4.2 大肠杆菌-粤蓝链霉菌属间接合系统的建立第86-87页
        5.4.3 PCR targeting系统在粤蓝链霉菌中的应用第87-91页
            5.4.3.1 利用PCR targeting系统构建粤蓝链霉菌突变株的策略第87-88页
            5.4.3.2 粤蓝链霉菌不产榴菌素突变株的构建第88-91页
    5.5 本章小结第91-93页
第六章 榴菌素生物合成基因orf20 的功能分析第93-113页
    6.1 引言第93-94页
    6.2 实验设备和材料第94-95页
        6.2.1 主要仪器第94页
        6.2.2 试验菌株第94页
        6.2.3 主要试剂第94-95页
        6.2.4 培养基和溶液配方第95页
    6.3 实验方法第95-101页
        6.3.1 引物设计第95-96页
        6.3.2 重组表达载体的构建及诱导表达第96-97页
        6.3.3 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析第97-98页
        6.3.4 重组蛋白ORF20 的纯化第98-99页
        6.3.5 orf20 的体内敲除第99页
        6.3.6 粤蓝链霉菌orf20 敲除株及重组大肠杆菌对PQ的抗性分析第99页
        6.3.7 链霉菌总RNA的提取第99-100页
        6.3.8 RNA的精制第100页
        6.3.9 RNA的质量检测及定量第100-101页
        6.3.10 反转录第101页
        6.3.11 荧光实时定量PCR第101页
    6.4 结果与讨论第101-111页
        6.4.1 orf20 的相关分析第101-102页
        6.4.2 orf20 的重组表达第102-105页
        6.4.3 粤蓝链霉菌orf20 缺失突变株的构建第105-107页
        6.4.4 粤蓝链霉菌突变株及重组大肠杆菌对百草枯的抗性分析第107-109页
        6.4.5 榴菌素外排基因orf15 的转录表达分析第109-111页
            6.4.5.1 内参基因hrdbsv的克隆测序第109页
            6.4.5.2 orf15 在粤蓝链霉菌中的转录表达规律第109-111页
    6.5 本章小结第111-113页
结论与展望第113-116页
参考文献第116-138页
附录第138-152页
攻读博士学位期间取得的研究成果第152-153页
致谢第153-154页
附件第154页
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