冠心病是世界上最常见的、致死率最高的慢性疾病之一。随着我国社会经济的快速发展、生活方式的改变以及人口老龄化,冠心病的发病率呈逐年增长的趋势。世界卫生组织预测我国每年有超过100万人死于冠心病。冠心病将严重威胁人民生命和健康,并为社会和家庭带来沉重的经济负担。为此,加强开展以冠心病为代表的心血管疾病的基础研究和人群防治工作,既是我国21世纪社会发展所面临的重大公共卫生问题,又是保障我国经济可持续发展、构建和谐社会的重大需求。冠心病的发生是多因素参与的复杂过程,更是环境因素和遗传因素共同作用的结果。众所周知,冠心病的发病与吸烟、肥胖、高血压、糖尿病、血脂异常等有关。但是,这些传统的危险因素仅能解释50%-60%冠心病的发病原因,另外有40%-50%的发病归因于遗传因素。冠心病家族史是影响冠心病发病风险的一个重要的独立危险因素。在对冠心病的病因学研究中,脂质浸润学说是最早被提出和证实的。冠心病的发生和发展是动脉粥样硬化的过程：由于血浆脂质水平较高,血浆脂质进入动脉内膜并沉积在内膜下,引起血管内膜的炎性免疫反应和血小板聚集,导致血栓和斑块形成,最终影响到心肌供血不足甚至缺血坏死。已经有大量研究证实血脂水平的改变与冠心病的发病有密切关系。高胆固醇血症等家系研究也证实了血脂水平受到遗传因素的影响。所以,在过去30年中对冠心病的遗传易感性研究主要以是血脂代谢相关基因作为候选基因来进行的。随着国际人类基因组测序计划的完成和单核苷酸多态性单体型图谱的构建完成,在全基因组范围内高效快速的筛选并定位复杂疾病或性状的遗传易感性位点成为当今世界的一个研究热点。自2007年以来,欧美国家在几十种常见复杂疾病(癌症、冠心病、糖尿病等)中开展了大规模的全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWAS)。据统计,近五年全世界共开展了大约600个GWAS,大约在150种不同的疾病或性状中找到了800个阳性遗传变异位点。2007年,《Science》杂志刊登了第一项与冠心病相关的GWAS结果之后,全世界已经通过GWAS发现了多个与冠心病发病相关的遗传变异区域(如染色体9p21、1p13等)。2008年,Kathiresan等人在欧美人群中通过GWAS发现多个影响血脂水平的多态性位点与冠心病的发病有关。但是,大部分的GWAS都是以欧美白种人作为研究对象进行,很少有在亚洲黄种人乃至中国汉族人群中进行的GWAS。在本研究之前,日本学者曾报道他们在日本人群中进行的血脂水平的GWAS。然而,该研究仅对甘油三酯和高密度脂蛋白水平进行了研究,但对病因学和临床诊断中更有意义的总胆固醇和低密度脂蛋白水平的遗传变异没有进行研究,更没有研究影响血脂水平的遗传变异与冠心病发病风险的关系。由于中国人与欧美人群的遗传差异和与日本人在环境和生活方式等的不同,在不同人种中发现和验证GWAS的结果,能够为探索其致病和易感性提供更可信的流行病学证据。因此,本研究拟从影响冠心病发病的传统危险因素血脂水平出发,以大样本人群为基础,在中国汉族人群中开展血脂水平的GWAS,并且在多个大样本的独立人群和冠心病的病例对照人群中验证上述阳性结果,试图通过筛选与血脂水平异常和冠心病发病相关的遗传变异来研究基因型-表型-疾病三者的关系,为揭示冠心病的发病机制并为制订防治策略提供依据。我们本研究共分为四个部分：第一部分中国汉族人群血脂水平的全基因组关联研究血脂水平异常是影响冠心病发病的一个重要因素。血浆中的血脂包括了总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等。人体内血脂水平受到多种因素的影响,包括年龄、性别、体重、饮食和体力活动等。家系研究也证实了遗传因素对血脂水平有很强的作用。本研究于2008年开始,建立起了2.7万人的同济-东风队列,收集了包括问卷调查、体检信息等资料和血液样本。我们在同济-东风队列的参与者中开展了血脂水平相关的GWAS.本研究分为发现和验证两阶段,在发现阶段,我们在队列中挑选了1461名健康中国汉族人,使用Affymetrix GeneChip Human Mapping 6.0芯片进行全基因组扫描,每个样本检测了666,141个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs).以P<10-5为选择标准,发现与血脂水平(总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白)有显著性关联的染色体区域和遗传变异位点。我们在另外两个独立的中国汉族人群样本中分两阶段验证上述全基因组扫描中有显著性意义的阳性SNPs.第一验证阶段,在3840人中对28个SNPs进行验证。验证结果显示,有12个SNPs位点,6个基因与血脂水平有显著性关联(P<0.05)。然后,我们将通过第一个验证阶段的12个阳性SNPs位点继续在另外一个有5374人的样本中进行第二阶段的验证,以上12个位点全部验证出了阳性结果。他们分别是：与总胆固醇水平有显著性相关的SNPs位点5个,全部位于1号染色体的DOCK7基因上(rs11207995.rs1168114. rs7518497、rs10889332和rs4350231)；与甘油三酯水平有显著性相关的SNPs位点6个,分别位于11号染色体的APOA4-APOA5-ZNF259-BUD13基因簇的4个基因上(APOA4上的rs7396835,APOA5上的rs651821,ZNF259上的rs6589566. rs964184和rs4417316,BUD13上的rs17119975)；与低密度脂蛋白水平有显著性相关的SNPs位点1个,位于19号染色体的TOMM40基因上(rs1160985)。用GWAS发现的SNPs对总胆固醇和甘油三酯水平进行基因型评分,发现了多个SNPs对血脂水平的累积作用以及基因型与血脂水平之间的剂量-效应关系。本部分我们在中国汉族人群中通过GWAS发现12个SNPs位点以及6个基因与血脂水平有显著性关联。新发现SNPs位点10个(DOCK7上的rs11207995.rs1168114. rs7518497.rs10889332和rs4350231,APOA4上的rs7396835,ZNF259上的rs6589566和rs4417316,BUD13上的rs17119975,TOMM40上的rs1160985)。第二部分影响血脂水平的遗传变异与中国汉族人群冠心病易感性的关联性研究血浆中的血脂水平是影响冠心病发病的一个重要因素。以低密度脂蛋白和总胆固醇水平为代表的血脂水平增高,会增加患冠心病的风险。已有研究证实,血脂水平和冠心病发病风险都受到遗传因素的影响。在第一部分我们通过GWAS已经发现了与血脂水平有关的遗传变异,但是,这些遗传变异是否通过改变血脂水平来增大了冠心病发病的风险有待于进一步证实。为了证实这个假说,本部分在中国汉族人群和欧美人群血脂水平相关的GWAS的基础上,寻找与冠心病发病风险有关的遗传变异位点。我们结合第一部分中国汉族人群血脂水平相关的GWAS的结果和欧美报导的血脂水平相关的GWAS的结果,在第一节中筛选了8个与血脂水平有显著性关联的SNPs,其中3个是在中国汉族人的GWAS中发现的SNPs,有5个是在在欧美白种人中发现并报道的与血脂水平相关的SNPs。我们分两阶段在冠心病的病例对照中进行研究：第一阶段,我们在1376对冠心病的病例对照中发现与冠心病发病风险有显著性关联的SNPs (P<0.05);第二阶段,将第一阶段筛选出来的阳性SNPs在另外1269例冠心病患者和2745例对照中进行验证。本部分第一节结果显示：位于染色体区域1p13的rs599839不仅与低密度脂蛋白水平有关(P=0.022),也与中国汉族人冠心病发病风险有显著性关联(OR=0.76,P=0.001)；位于染色体区域16q的rs16996148不仅与低密度脂蛋白和高密度脂蛋白有关(P=2.9×104和0.001),也与中国汉族人冠心病发病风险有显著性关联(OR=0.66,P=3.3×10-8)。这两个SNPs都是通过GWAS新发现的与血脂水平相关的遗传变异,虽然生物学功能有待于进一步研究,但是它们有可能成为治疗血脂异常或者冠心病的新的生物学靶点。另外,GWAS发现位于染色体6q26-27的基因簇SLC22A3-LPAL2-LPA上的遗传变异与欧美人种冠心病的发病有显著性关联。该区域上有编码血浆脂蛋白a [Lp(a)]的基因LPA。我们在2308名冠心病病人和2332名对照人群中,对该基因簇上的5个SNPs位点进行基因分型。校正了冠心病的传统危险因素后,我们发现3个SNPs位点rs3088442、rs7767084和rs10755578与冠心病的发病风险有显著性关联。其中rs10755578的G和rs3088442的A等位基因均能显著降低冠心病发病风险(分别为OR=0.91,95% CI 0.84-0.99, P=0.033和OR=0.92,95% CI 0.85-0.99), P=0.045)。由以上三个阳性SNPs构建的单体型ACG与GTC相比较,能显著性降低冠心病发病的风险(OR=0.84,P=0.01)。本部分的研究结果提示,在中国汉族人群中发现五个与血脂水平有关的SNPs (rs599839、rs16996148、rs3088442、rs7767084和rs10755578)与冠心病发病风险有显著性关系。其中rs599839和rs16996148是通过GWAS新发现的SNPs, rs3088442、rs7767084和rs10755578位于SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上。提示这些遗传变异可能通过改变血脂水平来影响冠心病发病的风险,这将为进一步阐明冠心病的发病机制和发现其干预靶点提供科学依据。第三部分染色体9p21区域遗传变异与中国汉族人群冠心病易感性的关联性研究冠心病的发生是多因素参与的复杂过程,是环境因素和遗传因素共同作用的结果。2007年,《Science》杂志刊登了第一项与冠心病相关的GWAS之后,全世界已经通过GWAS发现了多个与冠心病发病相关的遗传变异(如染色体9p21、1p13等)。通过前两部分的研究,我们发现了通过影响血脂水平来改变冠心病发病风险的遗传变异。然而,冠心病的GWAS还发现了一部分独立于任何传统危险因素存在的遗传变异,它们与我们已知的危险因素没有直接关联。本部分根据欧美冠心病GWAS的研究结果选择了一个新发现的与冠心病发病风险有很强关联的遗传区域。我们在中国汉族人群中验证这个独立的遗传区域,并且通过环境-基因交互作用分析发现其可能的致病机制。本部分在欧美白种人的冠心病GWAS的报道中挑选了一个新发现的与冠心病发病相关的遗传区域——染色体9p21区域。我们选择了该区域上的2个SNPs位点rs2383206和rs2383207在中国汉族人群1360对的冠心病病例对照样本中进行基因分型。结果显示：rs2383207的GG基因型频率在冠心病的病例对照样本中有显著性差异,调整其它危险因素后,与基因型为AA者相比,基因型为GG者患冠心病的危险性增加(OR=1.52,95%CI=1.13-2.04,P=0.015)。分层分析结果显示,在以下的研究对象中携带rs2383206和rs2383207的GG基因型的人患冠心病的风险增加：男性(分别是OR=1.57,95%CI 1.14-2.16和OR=1.96,95%CI 1.32-2.90),或者年龄小于60岁的人(分别是OR=1.35,95%CI 1.00-1.84和OR=1.58,95%CI 1.02-2.47),或者体重超重者(分别是OR=1.52,95%CI 1.00-2.33和OR=2.39,95%CI 1.41-4.05),或者吸烟者中(分别是OR=1.55,95%CI 1.10-2.20和OR=2.03,95%CI 1.34-3.08).基因与环境交互作用分析发现rs2383207与吸烟具有交互作用(P=0.037)。携带rs2383206和rs2383207危险等位基因G和冠心病家族史具有很强的累积效应(趋势检验P=7.0×10-6),同时携带4个等位基因G和家族史这五种危险因素的人患冠心病的风险增大了4.11倍(95%CI=1.80-9.35)。我的研究结果不仅证实了染色体9p21上的遗传变异位点与中国汉族人关心发病风险有显著性关系,还有一些新的发现：我们首次发现在男性、年龄小于60岁的人、吸烟者和体重超重者中,携带rs2383206或者rs2383207 GG基因型的人患冠心病的风险都增大；并且还发现rs2383207的基因型与冠心病的传统危险因素(性别和吸烟)有交互作用。本部分结果表明：染色体9p21上的遗传变异位点rs2383206和rs2383207与中国汉族人的冠心病发病有关,G等位基因携带者患冠心病的危险性增加。危险等位基因G和冠心病家族史具有很强的累积效应。第四部分SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇阳性位点的功能研究3’UTR一般位于基因下游3’端,它能维持mRNA的稳定,一般还含有microRNA的结合位点,可能影响转录子的翻译,最终影响到基因的表达水平。第二部分研究发现位于SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇下游3’UTR区域的SNPs位点rs3088442与中国汉族人群冠心病的易感性有显著性关联。通过生物信息学软件预测分析发现,位于3’UTR区域的rs3088442位点是多个microRNA的结合位点,可能会影响到mRNA的稳定性。因此,本部分对rs3088442位点进行了功能研究。我们采用报告基因实验检测了rs3088442位点不同等位基因对报告基因荧光素酶活性的影响。结果发现在HepG2细胞株中,SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇下游3’UTR区域含rs3088442-G等位基因的质粒荧光素酶活性明显高于含rs3088442-A等位基因的质粒(P<0.05)。本部分的结果提示SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇下游3’UTR区域的rs3088442-G等位基因可以增强荧光素酶的表达和活性。该位点可能是通过影响microRNA的结合来影响了SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇mRNA的稳定性,从而对该基因簇基因表达起调控作用。综上所述,本研究从中国汉族人群的GWAS出发,探讨了遗传变异对血脂水平的影响,进一步以冠心病的病例对照人群为研究对象,探讨这些遗传变异对冠心病发病风险的影响,同时还在中国汉族人群中证实了位于染色体9p21区域的遗传变异与冠心病易感性的关联,并且对SNP的功能进行了初步研究,结果表明：1.在中国汉族人中进行的GWAS发现,6个基因上的12个SNPs位点与血脂水平有显著性关联,其中新发现SNPs位点10个。2. GWAS新发现的影响血脂水平的SNPs rs599839和rs16996148与中国汉族人的冠心病发病风险也有显著性关联,可能是通过升高血脂水平来提高了冠心病发病的风险。3.位于SLC22A3-LPAL2-LPA基因簇上的SNPs rs3088442、rs7767084和rs10755578与冠心病的发病风险有显著性关联。位于该基因簇下游3’UTR区域的rs3088442-G等位基因可能提高了该基因簇基因表达水平,从而使血浆Lp(a)水平提高来增加了冠心病发病的风险。4.染色体9p21的SNPs rs2383206和rs2383207与冠心病的发病风险有显著性关联,这两个SNPs的危险等位基因G与冠心病家族史有很强的累积效应,基因-环境交互作用分析发现rs2383207与吸烟具有交互作用。本研究的创新之处在于：1.首次在中国汉族人群中进行血脂水平相关的GWAS,不仅验证了欧美白种人GWAS的结果,同时也在中国汉族人中发现了一些新的与血脂水平相关的遗传变异和基因区域。2.将新发现的与血脂水平相关的遗传变异位点在冠心病的病例对照人群中进行进一步研究,从基因型-表型-疾病三个方面出发,分析了遗传变异-血脂水平改变-冠心病易感性之间的关系,不仅从生物学机制和致病机制上解释了SNPs的功能,还可能为冠心病的防治提供新的治疗靶点。3.首次在中国汉族人中证实了染色体9p21区域上的遗传变异对冠心病发病风险的影响,并且发现了该区域基因-环境的交互作用以及多个危险因素间的累积效应。4.在多中心的独立样本中验证了GWAS和病例对照研究的结果,有严格的流行病学设计,并且用体外细胞实验证实了阳性SNP的功能。尽管本研究已经取得了一些新颖和重要的结果,但由于研究时间限制,尚有许多不足和仍有许多待深入研究的地方：1.本研究发现和证实的一些新的遗传变异位点和区域,多数位于基因“荒漠区”生物学功能尚不明确,不适于采用报告基因等简单的实验,需要做Fine-Mapping和远程调控实验等来进一步研究其功能和致病机制。2.在血脂水平相关的GWAS中,由于参与GWAS发现阶段的样本量较小,因统计学力度不足难以发现作用较小或者频率较低的易感位点。3.由于资金和时间的原因,我们还没有在中国汉族人的冠心病的病例对照中进行GWAS,采用GWAS仍是目前揭示遗传变异与疾病发病风险关系的一个重要研究工具。4.由于时间的限制,队列研究仍处于起步阶段,还没有进行前瞻性研究和冠心病发病风险的预测；同样的,由于职业因素和环境因素对于人体的危害是复杂且长期的过程,本队列研究主要关注的职业有害因素对血脂水平与冠心病发病风险的影响还没有进行深入研究和探讨。
