樟芝菌发酵生产Antrodins等活性产物的研究

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樟芝菌,又名牛樟芝,是我国台湾特有的珍稀食用和药用真菌,可产三萜、多糖、甾醇、苯环类化合物等多种活性成分;樟芝培养物具有保肝、抗癌、调节免疫力、抗炎症等药理活性。近年来,许多学者研究发现,樟芝菌丝体产物具有与子实体相近的药理活性功能。同时,樟芝菌丝体产物中鉴定出的Antrodins和Antroquinonol类化合物,在保肝、抗癌方面具有卓越的疗效。但是目前关于樟芝菌丝体产物中特征活性成分系统的鉴定分析较少,使得樟芝菌丝体产物的发酵调控缺乏目标性,产物的质量控制也不明确。大多数的发酵研究都是关于多糖、菌体量等非特征性活性产物,使得樟芝菌丝体产物的品质始终处于较低水平,市场竞争力差。本课题的目的是通过对樟芝菌丝体产物活性成分较为全面的鉴定解析,从中筛选出樟芝菌丝体产物的指标化合物,对来源不同的樟芝发酵产物HPLC图谱进行了对比分析;根据筛选出的指标化合物,对樟芝固态发酵和液态发酵两种人工培养方法进行优化,研究工艺条件和产物后处理方式;针对液态发酵产物的不足,建立高通量生产樟芝活性产物的耦合发酵方法,为樟芝的进一步推广打下基础。本课题主要研究结果如下:(1)利用柱层析、制备HPLC等技术,对樟芝发酵产物中的活性成分进行了鉴定解析。从樟芝产物中纯化出8个化合物,经质谱、核磁等手段分析,这8个化合物分别为:Ergostatrien-3β-o(lAC-1);Antrodin C(AC-2);Antrodin B(AC-3);Antrodin A(AC-4);Antroquinonol ( AC-5 ) ; Antroquinonol B ( AC-6 ) ;4,7-Dimethoxy-5-methyl-1,3-benzodioxole(AC-7);Ubiquinone-3(AC-8)。(2)对来源不同的樟芝发酵产物HPLC图谱进行了对比分析。通过分析可知,无论是樟芝固态发酵还是液态发酵产物,其活性物质与樟芝子实体还是有一定的差异,但是也有其自身的特点。樟芝液态发酵产物,其主要活性成分为Antrodins类化合物,尤其以Antrodin C含量最高。樟芝固态发酵产物,其主要活性成分为Antrodins类和Antroquinonol类化合物,各组分的含量较为均衡。(3)对樟芝固态发酵过程中影响Antrodins的因素进行了优化。实验确定的最适培养基(/1 L锥形瓶)为:大米100 g,黄豆粉0.6 g,K2HPO4 0.05 g,MgSO4 0.05 g。培养基初始含水量为52%,接种量为35%(v/m),培养24 d。发酵过程温度采用变温调控,第一阶段培养温度为28℃,培养16 d后将发酵温度调整为25℃继续培养8 d。在最佳培养条件下,樟芝固态发酵产物中Antrodin A-C的含量高达3096.9 mg/kg、6876.7 mg/kg和8095.7 mg/kg。(4)利用Plackett-Burman design和Box-Behnken响应面分析法,优化了樟芝液态发酵培养基成分对Antrodin C产量的影响,并建立了模型。得到最优液态发酵培养基为:葡萄糖72 g/L、黄豆粉5.91 g/L、MgSO4 0.614 g/L,樟芝液态发酵培养基理论上产Antrodin C的最大值178.59 mg/L。根据上述回归分析结果和响应面实验特点,在实验水平内安排验证实验,发酵7 d后实际产Antrodin C为177.83±0.32 mg/L,该模型能较好地预测实际产Antrodin C情况。(5)研究了樟芝液态发酵过程中高溶氧对樟芝活性产物Antrodin C合成的影响。结果显示,三种方式均可以在发酵中后期大幅度提高发酵液溶氧水平,从而提高Antrodin C产量。其中添加氧载体十二烷、流加过氧化氢是较适合樟芝液态发酵的方式。(6)考察调节细胞通透性对樟芝产Antrodin C的影响。添加0.3%M,胞外Antrodin C含量从41.72%提高到74.60%;摇瓶实验中,在发酵第4 d添加0.5%M,Antrodin C产量高达322.17 mg/L,比对照提高了84.03%。(7)将调解细胞通透性与原位萃取相结合,提出了能有效提高樟芝液态发酵生产Antrodins和Antroquinonol类化合物的原位萃取发酵技术。优化的耦合发酵体系为:在发酵第4 d添加0.7%表面活性剂M,之后在第5 d加入10%原位萃取剂十二烷,同时在发酵第4 d开始流加0.15 mmol/L/h过氧化氢提高发酵液溶氧。通过耦合发酵,Antrodin C总含量高达455.78 mg/L,而十二烷萃取相中Antrodin C和Antroquinonol的含量分别高达2624.42 mg/L、489.09 mg/L,(8)对樟芝菌丝体产物的一般性成分进行了分析,实验结果表明,樟芝产物含有丰富的高级脂肪酸、氨基酸、腺苷、活性多糖等营养功能成分,并且在发酵过程中能产生丰富的挥发性香气成分。
摘要第3-5页
ABSTRACT第5-6页
第一章 绪论第10-22页
    1.1 樟芝介绍第10-11页
        1.1.1 樟芝名称变革与分类学地位第10页
        1.1.2 樟芝生物学特性第10-11页
    1.2 樟芝产物生物活性的研究第11-13页
        1.2.1 抗癌活性研究第11-12页
        1.2.2 保护肝脏活性第12-13页
        1.2.3 抗炎症活性第13页
        1.2.4 抗氧化活性第13页
    1.3 樟芝活性成分的研究第13-18页
        1.3.1 营养成分及挥发性成分第14页
        1.3.2 活性多糖第14-15页
        1.3.3 三萜类化合物第15-17页
        1.3.4 马来酸和琥珀酸衍生物第17页
        1.3.5 泛醌类化合物第17-18页
    1.4 樟芝人工培养方式的研究现状第18-19页
        1.4.1 牛樟树椴木栽培第18页
        1.4.2 樟芝菌丝体人工培养第18-19页
    1.5 立题目的与意义第19-20页
    1.6 研究内容第20-21页
    1.7 论文总体策划第21-22页
第二章 樟芝菌丝体产物活性代谢产物的解析第22-44页
    2.1 引言第22页
    2.2 材料与方法第22-25页
        2.2.1 菌株第22页
        2.2.2 试剂第22页
        2.2.3 主要仪器第22-23页
        2.2.4 培养基及培养条件第23页
        2.2.5 实验方法第23-25页
    2.3 结果与讨论第25-42页
        2.3.1 樟芝活性产物萃取分离条件的建立第25-27页
        2.3.2 樟芝活性代谢产物的鉴定第27-37页
        2.3.3 樟芝发酵产物HPLC 图谱分析第37-42页
    2.4 本章小结第42-44页
第三章 樟芝固态发酵产ANTRODINS 类化合物发酵条件优化第44-58页
    3.1 引言第44页
    3.2 材料与方法第44-46页
        3.2.1 菌株第44页
        3.2.2 培养基第44页
        3.2.3 试剂与仪器第44页
        3.2.4 樟芝固态发酵产物中活性成分HPLC 检测方法的建立第44-45页
        3.2.5 樟芝固态发酵工艺的优化第45页
        3.2.6 分析检测方法第45-46页
    3.3 结果与讨论第46-56页
        3.3.1 樟芝固态发酵产物HPLC 分析方法的建立第46-47页
        3.3.2 樟芝菌在固态基质上的生长状况第47-48页
        3.3.3 樟芝固态发酵基质的选择第48-49页
        3.3.4 樟芝固态发酵外加氮源的选择第49-50页
        3.3.5 樟芝固态发酵黄豆粉添加量的选择第50-51页
        3.3.6 樟芝固态发酵时间曲线的研究第51页
        3.3.7 樟芝固态发酵初始含水量的选择第51-52页
        3.3.8 樟芝固态发酵接种量的选择第52-53页
        3.3.9 樟芝固态发酵培养温度的选择第53-54页
        3.3.10 变温调控对樟芝固态发酵产Antrodins 的影响第54-55页
        3.3.11 樟芝固态发酵产物后处理方式的选择第55-56页
    3.4 本章小结第56-58页
第四章 液态发酵优化提高樟芝ANTRODIN C 产率第58-74页
    4.1 前言第58页
    4.2 材料与方法第58-60页
        4.2.1 菌株第58页
        4.2.2 试剂第58页
        4.2.3 主要仪器第58页
        4.2.4 培养基及培养方法第58-59页
        4.2.5 实验方法第59-60页
        4.2.6 分析方法第60页
    4.3 结果与讨论第60-72页
        4.3.1 樟芝液态发酵菌体形态观察第60-61页
        4.3.2 碳源种类的预筛选第61-62页
        4.3.3 氮源种类的预筛选第62页
        4.3.4 Plackett-Burman 实验对樟芝液态发酵产Antrodin C 重要影响因素筛选第62-64页
        4.3.5 樟芝液态发酵产Antrodin C 关键影响因子浓度的确定第64-66页
        4.3.6 响应面法对樟芝液态发酵产Antrodin C 培养基组成的优化第66-69页
        4.3.7 樟芝液态发酵产Antrodin C 最优培养基配方的获取与验证第69页
        4.3.8 接种量对樟芝液态发酵产Antrodin C 的影响第69-70页
        4.3.9 培养温度对樟芝液态发酵产Antrodin C 的影响第70-71页
        4.3.10 装液量对樟芝液态发酵产Antrodin C 的影响第71-72页
        4.3.11 初始pH 对樟芝液态发酵产Antrodin C 的影响第72页
    4.4 本章小结第72-74页
第五章 樟芝活性产物ANTRODIN C 高效耦合萃取发酵系统的建立第74-92页
    5.1 前言第74页
    5.2 材料与方法第74-75页
        5.2.1 菌株第74页
        5.2.2 培养基第74页
        5.2.3 试剂第74页
        5.2.4 主要仪器第74页
        5.2.5 实验方法第74-75页
        5.2.6 分析检测方法第75页
    5.3 结果与讨论第75-91页
        5.3.1 溶氧对樟芝液态发酵产Antrodin C 的影响第75-82页
        5.3.2 细胞通透性对樟芝液态发酵产Antrodin C 的影响第82-86页
        5.3.3 调节细胞通透性耦合原位萃取双液相发酵系统第86-91页
    5.4 本章小结第91-92页
第六章 樟芝发酵产物的基本化学成分组成分析第92-106页
    6.1 引言第92页
    6.2 材料与方法第92-94页
        6.2.1 菌株第92页
        6.2.2 试剂第92页
        6.2.3 主要仪器第92页
        6.2.4 培养基及培养条件第92-93页
        6.2.5 实验方法第93-94页
    6.3 结果与讨论第94-105页
        6.3.1 樟芝人工培养菌丝体产物水分、蛋白质、粗脂肪和粗纤维的测定结果第94-95页
        6.3.2 氨基酸的测定结果第95-96页
        6.3.3 脂肪酸的测定结果第96页
        6.3.4 微量元素的测定结果第96-97页
        6.3.5 挥发性成分的测定结果第97-103页
        6.3.6 樟芝活性多糖测定结果第103-104页
        6.3.7 樟芝腺苷测定结果第104-105页
    6.4 本章小结第105-106页
主要结论与展望第106-110页
    主要结论第106-107页
    展望第107-110页
论文创新点第110-112页
致谢第112-113页
专业术语中英文缩略对照表第113-114页
参考文献第114-124页
附录1:樟芝中活性成分的鉴定图谱第124-134页
附录2:作者在攻读博士学位期间发表的论文第134页
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