急性冷应激大鼠组织和细胞热休克蛋白90表达及应激性损伤机理研究

热休克蛋白90论文 冷应激论文 T淋巴细胞论文 树突细胞论文 主动脉内皮细胞论文
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研究背景:突如其来的大雪和冰冻等极端气候使机体产生强烈的冷应激反应。应激性损伤受到广泛关注。冷刺激时神经内分泌激素水平发生改变,释放大量儿茶酚胺和糖皮质激素,使内环境发生改变,生理功能紊乱。这些应激激素水平的升高,既能反映应激的严重程度,同时能影响机体的炎症免疫反应。热休克蛋白90(HSP90)是重要的应激性蛋白之一,应激反应时迅速合成并激活,在蛋白质聚集、折叠、跨膜、运输和转位、稳定细胞骨架以及分子伴侣等方面发挥着重要的调节作用,抵抗早期应激性损伤。HSP90表达的增强,反映了机体适应和保护机制发挥作用,同时也说明应激可能造成了细胞功能受损。但目前较少研究通过系统观察组织细胞HSP90的表达评价机体冷应激性损伤程度。应激原的作用下HSPs可以“主动”分泌出胞或者由坏死细胞释放到细胞外作为损伤相关模式分子(DAMPs)介导炎症免疫反应,造成组织细胞的“二次损伤”。有研究中发现,重症创伤后,糖皮质激素(GC)分泌增多,肝脏糖皮质激素受体(GR)减少时HSP70表达增加,以对抗GR下降所致的脏器损害,但机体出现炎症反应失控,发生明显的继发性损害。研究发现释放到细胞外HSP70,可能作为免疫系统的危险信号(danger signal),改变免疫微环境,与抗原递呈细胞相互作用而诱导免疫反应,或是与单核细胞表面的TLR4受体结合,启动先天性免疫应答,促进TNF-a、IL-6分泌,诱发机体炎症反应。在冠状动脉粥样硬化的研究发现,不稳定斑块中HSP60可作为抗原,诱导特异性T淋巴细胞的亚型CD28克隆发生改变,增殖成一群功能多样的CD4~+CD28~-T淋巴细胞。在自身免疫性疾病研究中发现CD4~+CD28~-T是一类具有天然杀伤靶细胞作用,且能抗自身细胞凋亡长寿的T细胞。目前CD4~+CD28~-T细胞的产生机制不明确,推测可能是由有限数量的抗原刺激产生,寻找诱导CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖的抗原具有重要的临床意义。有学者提出在应激损伤的过程中,细胞外的HSPs作为“交通枢纽”影响和放大周围细胞的炎症免疫损伤,但是目前分泌和调节机制不明,于是提出HSPs在应激性损伤中作用有广阔的研究空间。最近的研究发现,用H2O2作用内皮细胞后在培养液中检测到可溶性的HSP90,内皮细胞的HSP90表达升高,加入T淋巴细胞培养后检测到炎症因子表达升高,推测HSP90可能也是DAMP。但是更深入的研究目前未见相关报道。因此本研究探讨在急性冷应激中异常升高的HSP90,参与急性冷应激主动脉内皮细胞损伤的机制。研究通过观察急性冷刺激的不同时间HSP90在大鼠主动脉、脾脏和心肌组织、淋巴细胞的蛋白表达和血浆浓度的动态变化,从蛋白分子的角度阐述大鼠急性冷应激的损伤过程。通过研究外源性HSP90诱导急性冷刺激后主动脉内皮细胞炎性因子表达机制,探讨HSP90启动TLR-4介导的先天性免疫反应,参与大鼠急性冷应激后主动脉内皮细胞损伤。通过观察外源性的HSP90介导,急性冷刺激后大鼠脾脏树突状细胞成熟和抗原递呈功能增强,及脾脏T淋巴细胞激活和亚型的改变。以及HSP90特异性的细胞毒性T细胞对大鼠主动脉内皮细胞的损伤作用。并进一步观察HSP90作为免疫抗原能诱导具有细胞毒性作用的CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖。探讨HSP90通过抗原提呈激活获得性免疫反应参与大鼠急性冷刺激后主动脉内皮细胞损伤的机制。一、大鼠急性冷应激反应中激素、HSP90的动态变化及应激性损伤模型建立通过系统观察冷刺激的不同时间及冷刺激后的不同时间大鼠血浆儿茶酚胺和激素浓度的改变,检测大鼠心肌组织、胸主动脉、脾脏和外周血淋巴细胞以及血浆中HSP90的动态变化。观察在冷应激性损伤模型建立过程中,大鼠主动脉组织HSP90与GR蛋白的表达。为进一步探讨HSP90参与大鼠急性冷应激主动脉内皮细胞损伤机制提供实验依据。1.大鼠急性冷应激反应中血浆儿茶酚胺和激素的动态变化方法:大鼠在-4℃气候箱中冷刺激1h、3h、6h、12h、24h五个不同的时间,以及在每个时间点停止冷刺激后置于24℃环境中进一步观察即刻(0h)、1h、12h、24h四个时间点。采用放射免疫分析法(ELSA),检测各个时间点大鼠血浆肾上腺素(E)和去甲肾上腺素(NE),促肾上腺素(ACTH)和糖皮质激素(Cor)浓度。结果:-4℃冷刺激6h开始大鼠血浆E和NE浓度开始升高,12h达峰值,E和NE浓度分别是(9.11±0.52ng/ml;12.12±0.37pg/ml)比正常值(4.91±0.12ng/ml;3.13±0.12pg/ml)明显升高(P<0.01),以后逐渐下降,24h恢复期到正常。ACTH在6h时达峰(22.4±0.62pg/mL)比冷刺激前(12.36±0.33pg/mL)明显升高(P<0.01),24h降至冷刺激之前水平。Cor在6h开始升高,12h时达峰值(112.2±0.82ng/ml)明显高于应激前(70.12±0.23ng/ml)水平(P<0.01)。冷刺激结束后各个时间点观察E和NE的浓度变化不大。ACTH血浆浓度在冷刺激12h停止冷刺激后的1h(18.1±0.81pg/mL)高于冷刺激前水平(P<0.05),在12h和24h时无明显升高。而Cor血浆浓度在冷刺激12h停止冷刺激后的12h和24h(133.1±0.52;121.2±0.28)ng/mL明显高于冷刺激前(70.12±0.23ng/ml)水平(P<0.01)。大鼠急性冷刺激12h,儿茶酚胺和激素水平均明显升高,在停止冷刺激后,Cor血浆浓度仍然较高,且Cor与ACTH浓度升高不一致,推测Cor升高可能不完全依赖于下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴的调节,可能与HSP90的表达增强和糖皮质激素受体减少有关。2.HSP90在急性冷应激大鼠血浆、组织和细胞中的动态变化方法:采用Western-blotting方法检测大鼠急性冷应激反应中心肌组织、胸主动脉、脾脏和外周血淋巴细胞HSP90的蛋白表达,将蛋白表达胶片进行扫描,用Sicon Image J软件对Western blot条带进行灰度分析,然后计算蛋白相对含量:蛋白相对含量=(HSP9O/β-actin);用ELISA法检测血浆HSP90浓度。结果:在冷刺激3h时,心肌组织中的HSP90蛋白表达量明显升高,在3h、6h、12h表达量(1.2±0.02;1.1±0.17;1.05±0.01)比冷刺激前明显升高(P<0.01),随后接近正常水平;大鼠主动脉组织中HSP90表达在冷刺激6h开始升高,12h和18h表达量(1.5±0.05;1.4±0.06)比冷刺激前明显升高(p<0.05),24h开始下降但高于正常水平。大鼠淋巴细胞中HSP90的表达量在冷刺激1h就升高,比冷刺激前明显升高(P<0.05),在3h虽有所下降,但一直保持较高水平比冷刺激前明显升高(P<0.05),在12h和24h时升高更明显,在12h时达峰值,表达量(1.5±0.13)比冷刺激前显著升高(P<0.01)。脾脏中HSP90的表达,在冷刺激最初反应较慢,在12h、18h表达量(0.67±0.15;0.6±0.14)比冷刺激前明显升高(P<0.05)。血浆HSP90浓度,在冷刺激最初时间无明显改变,在12h(0.61±0.03)ug/ml比冷刺激前明显升高(P<0.05),在18h和24h一直在较高的水平。在冷刺激结束后不同的时间点观察到:冷刺激结束后对心肌HSP90影响不大。而主动脉冷刺激12h结束后,HSP90的表达在6h、12h、24h时间点均处于高水平。血浆淋巴细胞在冷刺激12h结束后HSP90表达量一直处于高水平。脾脏冷刺激12h结束后6h、12h、24h HSP90表达量均明显高于冷刺激前(P<0.05),血浆HSP90浓度,冷刺激12h结束后12h明显升高,一直保持较高的水平,但是在冷刺激24h后各个时间点,血浆HSP90浓度是下降。3.HSP90和GR在大鼠急性冷应激主动脉内皮细胞损伤模型建立中的表达方法:依据前面的研究实验分为四组:冷刺激12h后的即刻,(0h组、12h组、24h组)和冷刺激前组。用光学显微镜和透视电镜观察大鼠主动脉内膜的病理改变,用ELISA法检测血浆ET、NO和LDH浓度。Western-blotting方法检测主动脉HSP90和GR蛋白表达量及相关性分析。结果:大鼠胸主动脉病理检查,光镜可见0h组:内膜不光滑,血管壁层次清晰,中膜可见轻度肿胀。但是冷刺激后12h组和24h组,血管腔凹凸不平,内膜增厚,中膜可见肿胀,且弹性纤维排列不整齐,但是两组之间没有显著差别;电子透视镜检查冷刺激前主动脉内膜表现,冷刺激前内皮细胞呈梭形、扁平,表面平滑,细胞膜完整;0h组内皮细胞细胞膜不完整有破损和缺失,细胞核碎裂、溶解;12h组和24h组内皮细胞明显变大,呈空泡状连成一片,核固缩。冷刺激12h后的0h组、12h组和24h组:大鼠血浆ET浓度(138.55±5.78;173.24±11.23;168.08±12.12)ng/ml比冷刺激前明显升高(p<0.01);12h组和24h组比0h组明显升高(P<0.05)。NO浓度(45.12±8.27;31.21±8.24;22.45±12.9)umol/L比冷刺激前明显降低(p<0.01);12h组和24h组比0h组明显降低(P<0.05)。LDH浓度(372±13.24;435±21.31;473±12.21)IU/L比冷刺激前明显升高,(p<0.01);12h组和24h组比0h组明显升高(P<0.05)。急性冷刺激12h后大鼠主动脉组织中HSP90的蛋白表达量在0h组表达量为(0.89±0.16)比对照组升高,(p<0.05)。在12h组表达量为(1.23±0.22)和24h组表达量(1.4±0.25)比0h组明显升高(p<0.01),两组之间比较没有统计学意义。GR在主动脉组织中的蛋白表达量,在0h组为(0.92±0.012)h比对照组表达量明显升高(p<0.05)。而在12h组和24h组分别为(0.61±0.092;0.42±0.082)比0h组明显降低(p<0.01)。相关性分析,在冷刺激12h后12h组和24h组HSP90和GR的蛋白表达量呈负相关r=-0.537,p<0.05第一部分小结:⑴在冷刺激12h后,糖皮质激素下降缓慢仍保持在较高水平。⑵在冷刺激12h后主动脉组织,脾脏和外周血淋巴细胞HSP90表达增加,同时HSP90血浆浓度明显升高。⑶急性冷刺激12h后12h和24h主动脉组织GR表达量下降,HSP90表达量升高,主动脉内皮细胞损伤加重。确定急性冷刺激12h后为本实验的大鼠主动脉内皮细胞损伤模型。二、外源性HSP90诱导冷应激损伤后大鼠主动脉内皮细胞炎症因子表达的机制通过观察外源性HSP90刺激冷应激损伤后大鼠主动脉内皮细胞的TLR-4蛋白和TNF-α和IL-6炎性因子mRNA的表达,及TLR-4特异性阻断抗体干预后HSP90诱导内皮细胞炎性细胞因子表达的变化,探讨HSP90启动TLR-4先天性免疫反应参与急性冷应激后主动脉内皮细胞损伤。方法:采用原代培养急性冷刺激后各组主动脉血管内皮细胞,用外源性的HSP90刺激血管内皮细胞,western-bloting方法检测各组内皮细胞TLR-4蛋白表达,用荧光定量PCR检测TNF-α和IL-6炎性细胞因子的表达及TLR-4特异性阻断抗体干预后血管内皮细胞释放TNF-α和IL-6炎性细胞因子表达的变化。用ELISA法检测细胞液中LDH的浓度。结果:在急性冷刺激12h后大鼠主动脉组织中在0h组TLR4蛋白表达量为(0.69±0.06)比对照组升高,p<0.05。在12h组表达量为(0.93±0.22)和24h组表达量(0.98±0.25)比对照组明显升高(p<0.01);HSP90处理后各组细胞的炎症因子TNF-а和IL-6mRNA表达量0h组(6.31±0.63和7.31±0.15)倍;12h组分别是(8.24±0.17和10.1±0.11);24h组(9.12±0.16和11.1±0.15),各组均上调,比对照组明显升高(p<0.01)。0h组(422.31±7.53)IU/L;12h组是(568.24±9.17)IU/L;24h组(598.12±9.16)IU/L各组均上调,比对照组明显升高(p<0.01)。第二部分小结:⑴外源性的HSP90诱导冷应激损伤后大鼠主动脉内皮细胞TLR4表达升高,且12h组和24h组比对照组TLR4蛋白表达量明显升高,TNF-аmRNA和IL-6mRNA表达明显升高,LDH活性升高。⑵用TLR4特异性抗体阻断TLR4后,抑制HSP90诱导的各组内皮细胞炎性因子TNF-аmRNA和IL-6mRNA表达。⑶TLR4介导HSP90诱导急性冷刺激后大鼠主动脉内皮细胞损伤和炎性因子表达。三、外源性HSP90介导急性冷应激大鼠主动脉内皮细胞自身免疫损伤的机制通过观察外源性的HSP90介导冷应激损伤后大鼠脾脏树突状细胞(Dendritic cell,DC)成熟和抗原递呈能力增强,脾脏T淋巴细胞活性和CD4~+T淋巴细胞亚型的改变。以及HSP90介导的应激损伤后特异性的细胞毒性T细胞,对大鼠主动脉内皮细胞的损伤的作用。并进一步观察HSP90抗原递呈能诱导具有细胞毒性作用的CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖。探讨HSP90通过抗原提呈激活获得性免疫反应,参与大鼠急性冷刺激后主动脉内皮细胞损伤机制。1.外源性HSP90对冷应激损伤后大鼠脾脏树突状细胞和T淋巴细胞功能影响方法:分离培养冷刺激后大鼠脾脏DC和T淋巴细胞。流式细胞仪检测DC细胞的共同刺激分子CD86百分比,混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对同种异体T淋巴细胞的刺激能力,通过3H-TdR掺入法,用CPM值表示T淋巴细胞增殖的能力,用ELISA法测定MLR上清液中的IFN-γ,TNF-β,IL-4和IL-10细胞因子。采用3H-TdR掺入法检测刀豆素(ConA)抗原刺激脾脏T淋巴细胞的增殖,流式细胞术检测各组CD4T淋巴细胞的亚型以及用ELISA法检测HSP90与各组T淋巴细胞细胞液中IFN-γ浓度。结果:①在12h组和24h组的大鼠脾脏DC表面CD86百分比冷刺激前和Oh组明显增高,对同种异体T淋巴细胞刺激增殖的CPM值(26,334±4532;32,34±3127)比冷刺激前组CPM值(8,599±5745)明显升高(p<0.01),同时细胞液中细胞因子IFN-γ,TNF-β浓度(12h组,15.6±1.4;16.3±1.1)ng/L(24h组,18.1±2.1;19.0±1.4) ng/L比冷刺激前(6.8±1.1;7.4±1.9)ng/L明显升高(p<0.01)。②在12h组和24h组的大鼠脾脏T淋巴细胞的CD4CD28~-T淋巴细胞(73±10.5;80±11.2)%比冷刺激前百分比明显升高(p<0.01)。③5.0ug/ml ConA刺激各组大鼠脾脏T淋巴细胞在12h组cmp值=16,520±3421和24h组cmp值=18,230±7812比冷刺激前明显升高(p<0.01)。④HSP90与各组T淋巴细胞细胞液中IFN-γ浓度结果:12h组(14.4±1.1)ng/L和24h组(15.8±1.6)ng/L冷刺激前明显升高(p<0.01)。2.外源性HSP90诱导CD4~+CD28~-T增殖的研究方法:实验分为,10ug/LHSP90负载DC;20ug/LHSP90负载DC组和对照组。用密度梯度离心法分离人外周血(PBMC),体外细胞培养观察HSP9O负载DC细胞(HSP90-DC),免疫磁珠分选技术获得CD4~+T淋巴细胞,用流式细胞仪检测CD4~+T亚型CD28的百分比,ELISA检测细胞培养液中INF-γ细胞因子的浓度。用realtime RT-PCR,通过循环阈值(Ct)表达,7300pcr仪器软件分析结果,用2-△△Ct计算mRNA值,检测HSP90-DC细胞诱导的CD4CD28~-T淋巴细胞INF-γ、IL-2、TNF-a和GZMBmRNA值,用CFSE标记结合流式细胞术检测,流式细胞术百分比来表示CD4CD28~-T淋巴细胞对血管内皮细胞增殖的影响,流式细胞术检测阿托伐他汀干预HSP90负载DC细胞对CD4~+T淋巴细胞增殖的影响。结果:①免疫磁珠分选技术获得CD4~+T淋巴细胞纯度在(95±1.5)%,HSP9O负载DC能诱导CD4~+T淋巴细胞CD28表达下,10ug/LHSP90-DC和20ug/LHSP90-DC诱导CD4~+CD28~-T细胞百分比分别是(65±11.2;70±9.8%)比没有HSP90负载的DC组诱导CD4~+CD28~-T细胞百分比(22±7.9)%明显升高的(p<0.01),细胞液INF-γ浓度10ug/LHSP90-DC组(14.3±1.26)ng/L和20ug/LHSP90-DC组(15.4±1.15)ng/L比对照组明显升高(p<0.01),两个浓度的HSP90-DC组之间比较没有差别;②阿托伐他汀抑制HSP90负载DC细胞对CD4~+T淋巴细胞增殖的影响,阿托伐他汀组CD4~+CD28~-T细胞百分比(23.5±5.3)%比未干预组(57.2±2.3)%明显降低(p<0.01);细胞液中INF-γ浓度阿托伐他汀组(7.8±0.6)ng/L比未干预组(15.7±0.5)ng/L明显降低(p<0.01)。③定量PCR检测HSP9O-DC诱导产生的CD4~+CD28~-T细胞的INF-γ、IL-2、TNF-a、GZMBmRNA表达值比对照组明显升高(p<0.01)。而且HSP90-DC和CD4~+CD28~-T淋巴细胞混合组血管内皮细胞的增殖(10±11.2)%比对照组内皮细胞增殖量(45±15.3)%明显降低(p<0.01)。3.HSP90介导冷应激后特异性细胞毒性T细胞对大鼠主动脉内皮细胞损伤的研究方法:分离冷刺激大鼠12h后0h组、12h组和24h组的脾脏DC和T淋巴细胞,用流式细胞术检测各组DC刺激自体T淋巴细胞增殖,用MTT法检测,计算细胞的杀伤率(%)=(效应细胞孔A值+单纯靶细胞孔A值-细胞毒实验孔A值)/单纯靶细胞孔A值×100%,检测各组的DC细胞和自体的T淋巴细胞混合(CTL)对靶细胞大鼠主动脉内皮细胞(EC)与负载HSP90-EC细胞杀伤作用的比较;进一步用CFSE标记结合流式细胞术检测用阿托伐他(Ato)的干预后免疫细胞对内皮细胞增殖的影响以及用ELISA法检测混合细胞液的LDH浓度。结果:①各组DC刺激自体T淋巴细胞增殖观察到,冷刺激后12h和24h组的T细胞增殖(19.5±1.5;32±5.4)%比正常对照组(2.8±0.5)%明显升高(p<0.01);负载HSP90后的正常组DC刺激自体淋巴细胞增殖(42.1±5.4)%显著增强(p<0.01)。②12h组和24h组DC细胞和自体的T淋巴细胞混合(CTL)对负载HSP90的内皮细胞组的杀伤率(68.3±1.4;71.3±2.7)%比未负载HSP90的大鼠内皮细胞的杀伤率(13.4±1.9;15.6±2.3)%比较明显升高(P<0.01);各组CTL中加入CD4~+CD28~-T可以明显增强这一细胞毒性作用,各组之间负载HSP90内皮细胞组比未负载HSP90内皮细胞组杀伤率明显升高(P<0.01)。③冷刺激12h后12h组和24h组的DC及HSP90负载的DC诱导的CTL对负载HSP90-EC有高度的杀伤作用,Ato能明显抑制CTL对负载HSP90-EC的杀伤作用,Ato组内皮细胞增殖(60±10.5)%比对照组明显升高(p<0.01);且细胞液中LDH浓度Ato组(125±16.5)IU/L比对照组(270±14.8)IU/L明显降低(p<0.01)。第三部分小结:⑴冷应激12h后12h组和24h组,大鼠脾脏DC功能成熟,抗原递呈能力增强;脾脏T淋巴细胞HSP90特异性致敏,CD4~+CD28~-T淋巴细胞百分比显著增加。⑵体外试验证实HSP9O负载的DC能诱导CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖,而且CD4~+CD28~-T淋巴细胞炎性细胞因子INF-γ、IL-2、TNF-a和GZMBmRNA的表达升高,对血管内皮细胞增殖有明显的抑制作用,阿托伐他汀能抑制HSP9O诱导CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖,能降低细胞液中INF-γ浓度。⑶冷应激12h后12h组和24h组,大鼠脾脏DC及HSP90负载的DC诱导自体的,特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对负载HSP90-EC有高度的损伤作用,各组中加入CD4~+CD28~-T淋巴细胞对负载HSP90-EC的杀伤作用明显增强,阿托伐他汀能明显抑制HSP90介导的CTL对HSP90负载内皮细胞的杀伤作用。⑷初步验证了HSP90可以作为特异性抗原,诱导CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖,参与对负载HSP90的血管内皮细胞的自身免疫损伤作用。⑸阿托伐他汀能干预HSP90诱导的主动脉内皮细胞免疫损伤作用。结论:①急性冷刺激12h后主动脉组织HSP90表达升高,内皮细胞损伤。②HSP90可能启动了TLR4介导的先天性免疫反应,参与急性冷应激后主动脉内皮细胞损伤。③HSP90通过免疫抗原递呈诱导细胞毒性CD4~+CD28~-T淋巴细胞增殖,激活获得性免疫反应,参与急性冷应激后主动脉内皮细胞损伤。
摘要第3-12页
ABSTRACT第12-17页
中英文缩略词表第20-21页
前言第21-27页
    参考文献第25-27页
第1章 大鼠急性冷应激反应中激素、HSP90 的动态变化及应激性损伤模型建立第27-86页
    第1节 大鼠急性冷应激反应中儿茶酚胺和激素的动态变化第29-45页
        1.1.1 实验材料第29-30页
        1.1.2 实验方法第30-35页
        1.1.3 结果第35-40页
        1.1.4 讨论第40-42页
        1.1.5 小结第42-43页
        参考文献第43-45页
    第2节 HSP90 在急性冷应激大鼠血浆、组织和细胞中的动态变化第45-70页
        1.2.1 实验材料第45-48页
        1.2.2 实验方法第48-52页
        1.2.3 结果第52-59页
        1.2.4 讨论第59-65页
        1.2.5 小结第65-67页
        参考文献第67-70页
    第3节 HSP90和GR在大鼠急性冷应激主动脉内皮细胞损伤模型建立中的表达和意义第70-86页
        1.3.1 实验材料第71-72页
        1.3.2 实验方法第72-77页
        1.3.3 结果第77-81页
        1.3.4 讨论第81-83页
        1.3.5 小结第83-84页
        参考文献第84-86页
第2章 外源性HSP90 诱导冷应激损伤大鼠主动脉内皮细胞炎症因子表达的机制第86-102页
    2.1 实验材料第87-88页
    2.2 实验方法第88-93页
    2.3 结果第93-96页
    2.4 讨论第96-99页
    2.5 小结第99-100页
    参考文献第100-102页
第3章 外源性HSP90 介导急性冷应激大鼠主动脉内皮细胞自身免疫损伤的机制第102-160页
    实验材料与仪器第104-107页
    第1节 外源性的 HSP90 对冷应激损伤后大鼠脾脏树突状细胞和 T 淋巴细胞功能影响第107-123页
        3.1.1 实验流程第108页
        3.1.2 实验方法第108-113页
        3.1.3 结果第113-118页
        3.1.4 讨论第118-120页
        3.1.5 小结第120-121页
        参考文献第121-123页
    第2节 外源性 HSP90 的诱导 CD4~+CD28~-T 淋巴细胞增殖的研究第123-146页
        3.2.1 实验流程第124页
        3.2.2 实验方法第124-132页
        3.2.3 结果第132-140页
        3.2.4 讨论第140-142页
        3.2.5 小结第142-144页
        参考文献第144-146页
    第3节 HSP90 介导特异性细胞毒性 T 细胞对急性冷应激后大鼠主动脉内皮细胞损伤的研究第146-160页
        3.3.1 实验流程第147页
        3.3.2 实验方法第147-152页
        3.3.3 结果第152-156页
        3.3.4 讨论第156-158页
        3.3.5 小结第158-159页
        参考文献第159-160页
结论与展望第160-163页
致谢第163-164页
附图第164-165页
攻读学位期间发表的论文第165-166页
综述第166-174页
    参考文献第173-174页
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论文编号ABS4029088,这篇论文共174页
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