胰腺粘液性囊性肿瘤相关miRNAs筛选及细胞系构建的初步研究
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背景:胰腺粘液性囊性肿瘤(mucinous cystic meoplasms of pancreas, MCNs)是一类具有潜在恶变倾向的良性肿瘤,早期手术切除治疗预后好、复发率低。病变一旦由胰腺粘液性囊腺瘤(mucinous cystadenoma of pancreas, MCA)进展为粘液性囊腺癌(mucinouscystadecarcinoma of pancreas, MCAC)阶段,即可能丧失手术时机,并且该疾病对放疗、化疗等治疗手段均不敏感。因此,准确判断疾病进程对患者预后具有重要意义。但目前关于MCNs的发病机制尚未完全阐明,且缺乏敏感性、特异性好的分子标记物判断肿瘤的良恶性。microRNAs (miRNAs)是一种内源性的长约19~25nt的非编码小RNAs,通过作用于下游mRNA的3’UTR区域,广泛参与体内多种生物学功能的调控。相关研究表明肝癌、胃癌、结肠癌、食管癌等消化道肿瘤中均具有差异表达的miRNAs;同时,在急、慢性胰腺炎(acute pancreatitis or chronic pancreatitis,AP orCP)、胰腺导管内乳头状粘液瘤(interductal pillirary neoplasms, IPMN)、胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)、胰腺癌(pancreatic cancer, PC)等胰腺良恶性疾病中,也有差异表达的miRNAs发挥重要的生物学功能。据此,我们对MCNs的相关miRNAs表达谱进行研究,筛选差异表达的miRNAs,验证并分析预测相应的靶基因,探索其在MCNs发病中的作用,为揭示MCNs发病机制、寻找疾病早期诊断标志物提供理论依据。目的:筛选胰腺粘液性囊性肿瘤(MCNs)差异表达的miRNAs,寻找受其调控的靶基因,并摸索构建MCNs细胞系的培养条件。方法:1.收集2011年5月至2011年12月我院普外科术后病理确诊为MCNs的肿瘤组织样本,同时收集相应瘤旁组织作为对照,抽提miRNAs质检后进行表达谱芯片筛选。2.采用Taqman探针RT-PCR检测法对芯片筛选发现的差异表达显著的miRNAs进行验证。3.利用预测网站miRGEN(包含Targetscan、picTAR、miRanda)等对验证后的miRNAs进行靶基因预测及相关功能分析。4.外植块法、酶消化法、裸鼠接种法接种新鲜组织标本探索MCNs原代细胞培养条件,观察细胞形态并利用免疫组化的方法初步鉴定其细胞来源。结果:1.在收集到的9例标本中,3例配对组织达到miRNAs芯片质检合格标准,筛选出miR-192、miR-197、miR-224、miR-375四项差异表达基因。结果显示,miR-192上调3.31倍,余者均下调,分别为0.43、0.34、0.36倍。2.经RT-PCR法验证miR-192上调2.143倍,miR-197下调0.47倍, miR-224下调0.26倍,miR-375下调0.60倍,检测结果与芯片筛选结果基本一致。3.经生物信息学预测以上4项miRNAs的靶基因各有上千条,对各项miRNAs进行Kegg信号通路、GO功能注释等信息整合后,选取miR-224进一步分析其功能,拟定候选靶基因为Jagged1、L1CAM、SMAD4,分析结果提示miR-224与相应候选靶基因表达水平呈负相关。4.采用胶原酶V酶消化法可使细胞成功贴壁生长,上皮样细胞与成纤维样细胞混杂,上皮样细胞形态呈多角形,铺路石样生长。免疫组织化学染色结果显示上皮标记CK广谱角蛋白阳性。结论:1.胰腺粘液性囊性肿瘤相关miRNAs涉及miR-192、miR-197、miR-224和miR-375。2.胰腺粘液性囊性肿瘤相关miR-224靶基因可能涉及Jagged1、L1CAM、SMAD4。3.胶原酶V酶消化法可用于MCNs原代细胞培养。
摘要 | 第5-7页 |
Abstract | 第7-9页 |
缩略词表 | 第10-11页 |
引言 | 第11-13页 |
第一部分:胰腺粘液性囊性肿瘤相关 miRNAs 筛选、验证与靶基因预测 | 第13-39页 |
第一节 胰腺粘液性囊性肿瘤相关 miRNAs 筛选 | 第13-28页 |
前言 | 第13页 |
材料和方法 | 第13-19页 |
结果 | 第19-24页 |
讨论 | 第24-28页 |
第二节 胰腺粘液性囊性肿瘤相关 miRNAs 验证 | 第28-33页 |
前言 | 第28页 |
材料和方法 | 第28-30页 |
结果 | 第30-31页 |
讨论 | 第31-33页 |
第三节 胰腺粘液性囊性肿瘤相关 miRNAs 靶基因预测 | 第33-39页 |
前言 | 第33页 |
材料和方法 | 第33-36页 |
讨论 | 第36-38页 |
小结 | 第38-39页 |
第二部分:胰腺 MCNs 细胞系构建的初步研究 | 第39-48页 |
前言 | 第39页 |
材料和方法 | 第39-42页 |
结果 | 第42-45页 |
讨论 | 第45-48页 |
参考文献 | 第48-51页 |
全文小结 | 第51-52页 |
综述 胰腺粘液性囊性肿瘤 | 第52-60页 |
参考文献 | 第57-60页 |
在读期间发表论文 | 第60-61页 |
致谢 | 第61页 |
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