牡蛎常见原虫及其快速检测方法研究

派琴虫(Perkinsus)、包拉米虫(Bonamia)、马尔太虫（Marteiliarefringens）、闭合孢子虫（Mikrocytos）、尼氏单孢子虫(Haplosporidiumnelsoni)和沿岸单孢子虫（Haplosporidiumcostale)是养殖贝类最主要的寄生虫病病原，在许多国家和地区均有分布，被世界动物卫生组织（OIE）和亚太水产养殖网络中心（NACA）列入重要水生动物疫病名录。本研究对我国东南沿海海区养殖牡蛎中的寄生原虫感染情况进行了调查，对不同地区采集的派琴虫ITS基因序列进行了比对与分析，并建立了同时检测包拉米虫、派琴虫和尼氏单孢子虫的多重PCR检测方法。为贝类原虫在我国沿海的分布、流行、变异及疾病防控提供了重要的参考资料和技术支持。本研究内容包括四个部分：1、从厦门海区采集菲律宾花蛤和牡蛎样品，建立了派琴虫液体巯基乙酸盐培养法，成功培养到派琴虫休眠孢子，经卢戈氏碘液、吉姆萨染色和无染色三种方式对其形态学进行观察。同时观察到派琴虫以二分裂的方式进行繁殖。2、采用OIE推荐引物建立了六种常见贝类原虫病PCR检测方法和种类鉴定方法，并运用这些方法对我国福建、广东、海南等东南沿海八个地区采集的559份养殖牡蛎样本进行检测和种类鉴定，结果表明：我国东南沿海养殖牡蛎普遍存在包拉米虫、派琴虫、尼氏单孢子虫和沿岸单孢子虫的感染，没有检测到马尔太虫和闭合孢子虫。不同地区这几种原虫的感染率存在较大差异，福建地区派琴虫的感染率均较高，厦门高达47.83%；三亚和海口包拉米虫的感染率均在66.7%以上；广东和海南尼氏单孢子虫和沿岸单孢子虫的感染率均超过了平均感染率28.05%、38.29%。经种类鉴定发现此次检测到的包拉米虫为牡蛎包拉米虫，绝大部分派琴虫为奥尔森派琴虫，仅2株为北海派琴虫。3、建立了能扩增派琴虫ITS全序列的PCR方法，并对从抽样地区检测到的派琴虫ITS序列进行扩增、克隆和测序，进行序列多重比对及同源性分析。结果发现：奥尔森和北海派琴虫ITS序列全长分别为713bp和738bp，5.8S序列高度保守，种内和种间的碱基差异主要表现在ITS-1和ITS-2区域。同源性分析表明：东南沿海八个地区奥尔森派琴虫ITS序列的同源性在100%～99.3%之间，两株北海派琴虫的同源性为97.9%。4、以奥尔森派琴虫和尼氏单孢子虫的保守序列设计特异性引物，包拉米虫采用OIE推荐引物，建立了快速检测这三种原虫的多重PCR检测方法，该方法最低可以检测到10pg的重组质粒模板，且不受其他原虫，细菌和贝类组织的干扰。临床检验结果也表明该方法的检测结果与OIE推荐的PCR检测方法结果一致，而且更加高效、快速。目前关于贝类原虫在我国流行情况的资料还很少，尤其是包拉米虫、尼氏单孢子虫、沿岸单孢子虫、马尔太虫和闭合孢子虫，而本次对我国东南沿海养殖牡蛎感染情况的调查和种类鉴定弥补了这方面的空白；建立了多重PCR同时检测奥尔森派琴虫、包拉米虫和尼氏单孢子虫的方法；通过建立的派琴虫ITS完整基因序列的PCR扩增方法，首次测得了北海派琴虫ITS完整序列；填补了相应领域的空白，是本研究中较为新颖和有特色的地方，为贝类原虫的进一步研究奠定了基础。