[背景及目的]肝纤维化(hepatic fibrosis)是机体对慢性肝损伤的一种修复反应,是病毒性肝炎、血吸虫肝病及酒精性肝炎等慢性肝病发展到肝硬化的必经阶段,也是多种慢性肝脏疾病最终导致肝功能衰竭的主要病理改变和共同通路。延缓和防止肝纤维化是防治慢性肝脏病进展的关键。全球大约2亿人口受血吸虫病威胁,目前我国仍有12省有新发日本血吸虫病病例报道,日本血吸虫所致肝硬化仍严重影响人们的生活及健康。肝纤维化是细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)增生和降解不平衡,导致可逆性积累的结果。大量研究支持肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的持续激活是肝纤维化发生发展过程中的关键环节。生理条件下HSCs处于静息状态,当肝脏受到各种病因(如血吸虫虫卵诱发的Ⅳ型超敏反应)刺激时,HSC的表型和功能会发生变化,如脂滴、维生素A丢失、某些蛋白表达增加如a-平滑肌蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)、突触素(synaptophysin, syn)、热休克蛋白47(heat shock protein, HSP47),并释放一些细胞因子如转化生长因子(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)等,通过细胞因子的级联放大作用促进自身进一步活化。自身进一步活化后,HSCs所发挥的功能效应主要表现为合成和分泌含有大量胶原纤维(Ⅰ和Ⅲ型胶原)的ECM。调节ECM降解的酶类主要有基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)与组织金属蛋白酶抑制剂(Tissue inhibitor ofmetalloproteinase, TIMPs), TIMPs是抑制MMPs活性的一组多功能因子家族,MMPs与TIMPs以1：1的比例形成MMP-TIMP复合体,阻断MMPs与胶原底物结合,从而抑制MMPs的活性,降低胶原的降解。在肝纤维化生成和进展中纤溶系统有双重作用：其一,降解窦周间隙细胞外基质,破坏细胞之间的正常联系而促进HSCs的增殖和迁移；其二,通过TGF-β1的活化,上调PAI-1和TIMPs的合成,从而促进细胞外基质的合成和沉积,并且抑制纤溶酶的生成和基质降解。HSP47 (heat shock protein 47, HSP47)是机体受到应激后合成增加的应激蛋白,主要存在于胶原合成细胞(如肝星状细胞)的内质网中,已发现在多种疾病纤维化病理过程中HSP47上调与胶原的合成和纤维化进展在时间和分布上呈正相关,抑制HSP47的表达,可以抑制胶原合成及抑制组织纤维化,而与肝纤维化关系的研究目前尚处于探索阶段。热休克蛋白47在血吸虫病肝纤维化过程中扮演的角色和作用尚未见报道,尤其对活化HSC功能效应的影响研究甚少。基因水平干预“有害”基因高表达可以更好地阐明该基因在疾病的发生发展中重要作用,也为探索肝纤维化临床治疗方法提供了新的思路。研究发现,尾静脉高压注射可以使质粒-DNA在小鼠肝脏获得高效表达。尾静脉高压注射,可延长质粒-DNA在肝窦中的停留时间,此外,多数药物的首关代谢在肝脏进行,质粒-DNA被肝组织细胞摄取。利用该方法针对HSP47基因进行干预后对血吸虫肝纤维化病程的影响,进一步阐明其作用机制有重要意义。第一部分HSP47在日本血吸虫病肝纤维化组织中的表达目的观察HSP47在临床日本血吸虫病肝脏组织中的表达情况及血吸虫病肝纤维化小鼠动物模型中的动态变化,旨在探讨HSP47在肝纤维化进程中的作用。方法1.收集2008年～2011年间同济医院门诊和住院部的部分血吸虫病肝纤维化患者肝穿标本及临床资料48例。免疫组织化学及Real-time PCR检测HSP47、TGF-p1、CTGF及Ⅰ型胶原的表达,HE染色和Masson染色观察病理改变和胶原纤维沉积状况。2.将血吸虫尾蚴(20±1)经腹部皮肤感染Balb/c小鼠,建立实验性血吸虫病肝纤维化小鼠模型,同时设正常对照组。分别在感染后第6周及12周取小鼠肝脏,HE及Masson染色观察病理改变,免疫组织化学和Real-time PCR检测HSP47、TGF-β1和Ⅰ型胶原的表达。结果1.与正常对照组比较,S2期肝纤维化小鼠汇管区和肝小叶内有大量纤维组织增生和纤维沉积,至S4期时,肝小叶结构已被破坏,同时中心静脉区和汇管区出现纤维间隔。Masson染色结果显示：与对照组比较,肝纤维化组组织中胶原在肝间质区显著增多,且肝组织内胶原含量随纤维化分级同步增高。2.免疫组化结果显示：与对照组比较,肝纤维化组织中HSP47及肝星状细胞活化标志(α-SMA)表达亦显著增加,且在汇管区、间质区发生纤维化区域明显；TGF-β1表达显著增加,其主要集中在炎症浸润、纤维化形成区。3.选取S0-S4期患者肝活检组织,Real time PCR检测HSP47-mRNA表达,随肝纤维化进展逐渐增加,且于S3期达高峰,于S4期略下降,但二者与SO期HSP47的表达相比较,仍有统计学差异。同时,分析肝活检组织病理炎症分级与HSP47表达的关系,无明显相关性。4. TGF-β1、CTGF、CollagenⅠ在血吸虫病肝纤维化患者不同纤维化分期中的表达：实验结果示TGF-β1在肝纤维化S1期即有表达,且S2期与S1期相比,差异具有显著性；CTGF在肝纤维化S2-S4期中分别与S0期相比,均显著增加；肝组织内Ⅰ型胶原含量与肝纤维化分级一致,S1-S4期与S0期相比,其表达均有统计学差异。5.日本血吸虫小鼠ALT和AST水平于感染第6周达到高峰,与感染前相比,均显著增高,达峰值后开始回落,至感染第12周基本接近感染前的水平。小鼠肝组织形态学改变：感染第6W,肝组织HE及Masson染色均可见虫卵沉积,至感染第12W,肝组织HE染色可见纤维组织沿虫卵肉芽肿呈干线性生长,Masson染色示大量蓝色胶原纤维沉积。6.日本血吸虫小鼠肝组织HSP47-mRNA于感染第6W、8W、12W表达较感染前均显著升高(p<0.01),并在感染第8周达峰值,后有所回落,但仍高于正常表达。Western-blot检测HSP47随感染后纤维化进展,其表达逐渐增加(p<0.01)结论HSP47及TGF-β1、CTGF在临床肝纤维化和血吸虫动物模型组织中表达上调,且HSP47与胶原表达部位一致,HSP47促纤维化作用与其增加胶原蛋白合成有密切关系,且TGF-β1、CTGF网络调节参与血吸虫肝纤维化的进程第二部分HSP47-shRNA的构建及其细胞水平对HSP47表达的影响目的针对肝纤维化发病关键基因构建HSP47-ShRNA,初步验证其能否在体外NIH/3T3细胞系干预HSP47基因的表达,并观察其对该细胞功能学的影响。方法1.设计HSP47-shRNA模板,并将其分别设计于U6启动子的F游引物,将U6启动子及其下游HSP47-shRNA的模板双链DNA装入载体,构建pGCsi-U6/Neo/HSP47-shRNA。2.细胞水平转染HSP47-shRNA与非相关干扰质粒作为对照,分别于24h、48h收集细胞,采用Real-time PCR、Western-blot技术检测HSP47 mRNA及蛋白水平表达；Real-time PCR和ELISA法检测TGF-β1。同时观察对该细胞分泌胶原功能的影响。结果1.成功构建HSP47-shRNA载体,通过脂质体介导转染入NIH/3T3细胞,转染效率约60%。转染12h,可见少量绿色荧光细胞,随转染时间的延长,细胞荧光表达量逐渐增加,各干扰质粒于转染72h荧光表达最强。2. ShRNA干扰显著抑制HSP47的表达,且ShRNA-HSP47-1于转染24h对HSP47的沉默效率最佳,为(25.83±1.794)%。TGF-β1,随HSP47表达下调,有一定程度抑制,与未干预空白组及非相关对照组比较均有统计学差异。3.HSP47经干预后,NIH/3T3细胞胶原合成和分泌明显减少,且以ShRNA-HSP47-1转染24h抑制最明显,与空白组比较有显著性差异。结论成功构建了HSP47-shRNA干扰质粒,并初步证实其对HSP47的表达干预有效,为进一步的体内干预实验奠定了基础。第三部分HSP47-shRNA对血吸虫尾蚴诱导的鼠肝纤维病程的干预作用目的观察HSP47-shRNA血吸虫肝纤维化小鼠体内HSP47的表达及对引起肝纤维化的细胞因子网络的调控,最终明确HSP47对血吸虫小鼠肝纤维化病情发展的影响。方法1.建立日本血吸虫感染小鼠的动物模型,于感染第6W经尾静脉高压注射,1次/周,体内转染HSP47-shRNA,干预至感染第14W,检测目的基因在肝脏的体内表达效率；2.将HSP47-shRNA通过尾静脉高压注射后,观察小鼠生存率,并于感染第6W、8W、14W动态记录脾脏指数、肝组织大体、血清生化学改变、肝组病理学改变。3.取感染第6W、8W、14W肝组织石蜡切片行天狼星红-苦味酸染色,偏振光显微镜下阅片,利用Image-Pro-Plus 6.0图像分析软件对肝组织总胶原及Ⅰ、Ⅲ型胶原定量。4.通过Real-Time PCR、免疫组化、ELISA、Western-blot等技术检测各干预组间HSP47表达下调情况,以及其干预后对胶原合成、细胞因子(TGF-β1、CTGF、IL-13、IL-17、MMP-9、TIMP-1及PAI-1)表达的影响。结果1.不同浓度HSP47-shRNA对血吸虫病肝纤维化小鼠模型干预至感染第14W,高、中、低剂量组生存率分别为33.33%、25%、25%,非相关对照组为16.67%。2.HE染色示肝纤维化较对照组明显减轻；Masson染色提示：肝内胶原沉积较对照组明显减少。3.干预HSP47表达后,与PBS组及非相关对照组相比,IL-13、IL-17、TGF-β、CTGF、TIMP-1下降显著,MMP-9、PAI-1升高明显,差别均具有显著性(p<0.05)；星状细胞活化的标志(a-SMA)表达明显降低；肝内胶原蛋白(collagenⅠ/Ⅲ)明显减少。结论干预HSP47表达,可以明显改善肝纤维化,HSP47除了可以影响胶原蛋白的表达,还涉及影响肝纤维化的细胞因子调控网络,通过上调MMP-9、下调PAI-1促进胶原降解是HSP47-shRNA抗纤维化机制之一,究竟通过何种途径等,有待进一步研究。
