肝门部胆管癌N-糖组学及microRNAS的研究

胆管癌(Cholangiocarcinoma)又称Klatskin瘤，是指原发于胆囊管开口以上的肝总管至左、右肝管部，位于粘膜上皮的恶性肿瘤，约占肝外胆管癌58％--75%以上，组织学类型多为腺癌.近年来其发病率呈上升趋势,但是其发生机制、发病原因及诱因不明确,因为其起病隐匿，所以出现临床症状—黄疸、腹痛时大多已到晚期，早期诊断困难,而且由于肝外胆管癌所处的特殊解剖位置及其向周围组织、血管、神经浸润的生物学特性，外科根治性切除率低，预后较差，且术后肿瘤复发率较高，其死亡率亦呈逐年上升趋势。现在对于肝门部胆管癌的诊断主要靠B超、CT、MRCP、PTCD等影像学的检查，虽然上述检查对于晚期肝门部胆管癌检查准确性较高，但是对于早期肝门部胆管癌却无法诊断，对于病人的愈后和生存时间无明显提高，一般认为对肝门部胆管癌敏感性较高的指标有CEA、CA242、CA50、CA199。上述标记物血中的阳性率虽较高，但缺乏特异性，对于早期病人敏感性较差，所以寻找对于肝门部胆管癌早诊断、早治疗的非创伤性肿瘤标志物显得尤其重要。多糖和蛋白质、核酸一起构成生命的三类大分子。多细胞生物表面覆盖的糖链具有广泛的生物学意义，如影响细胞的发育、分化和形态的维持，参与细胞免疫和细胞间识别，组成血型抗原，作为恶性细胞标记等；糖蛋白中的糖链在蛋白质的折叠，运输和定位中也起着重要作用。糖链的这些功能也是其与多种疾病相关的基础，在急性或慢性炎症性疾病，自身免疫病、恶性肿瘤等疾病的发生、发展过程中均可发现糖蛋白的糖链组成或糖基化程度的改变。异常糖基化的数量及质量上的变化有望成为这些疾病早期非创性诊断的依据。如今，随着凝集素微阵列技术、基质辅助激光解吸离子化飞行质谱(MALDI-TOF)等技术被引入糖组学的研究，糖链的检测有了很大的进展。Callewaert等利用ABI377DNA测序仪对血清蛋白N-糖链检测技术的建立更是为我们提供了简单、快速、高通量检测N-糖链的方法，使血清N-糖链检测运用于临床诊断和预测成为可能。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一种内源性编码小分子RNA，长度约为21～25个核苷酸组成，广泛存在于真核生物中，通过碱基配对与靶基因进行相互作用来降解靶mRNA或抑制靶基因的翻译，从而对基因进行转录后的表达调控，参与生物体内多种重要的生物学进程。许多研究表明，miRNA在人体肿瘤的发生和发展过程中发挥非常重要的作用，已发现若干miRNA与原发性肝癌、胃癌、小细胞型肺癌和胰腺癌等的发生和发展有着密切的关系。m iRNA表达不仅在组织中发生变化，在外周血循环中的miRNA的表达也会发生变化并且其在血液中十分稳定，这些变化与肿瘤的发生和发展密切相关，这些改变可作为肿瘤等疾病的诊断标志物，为临床疾病的早期诊断提供新思路。对于外周血中肿瘤特异性miRNA的检测，可以对肿瘤的早期诊断、早期治疗起到至关重要的作用。第一部分：肝门部胆管癌大样本临床病例N-糖组学研究本研究从肝门部胆管癌患者血清N-糖组分析入手，评估N-糖链以及N-糖链相关的多指标联合诊断模型在肝门部胆管癌早期诊断的价值。我们采用DSA-FACE的方法，检测了98例研究对象（44例胆管癌患者，9例先天性胆管囊肿，17例胆结石患者和28例正常对照）的血清N-糖组图谱，比较胆管癌、胆管囊肿及胆管结石状态下其特征性改变，并分析各峰值的差异。应用完全随机方差分析，并用ROC曲线评估各指标的诊断效力。结果发现，两个N-糖链结构（peak10, Peak9）可作为胆管癌的特异性诊断标志物；peak1及peak2可以作为胆管囊肿的特异性标志物。peak10及CA19-9在诊断胆管癌的诊断效力较高，其AUC均大于0.8，CA199-9在区分胆管癌及正常对照是的诊断效力比peak10要高，但是peak10在区分胆管癌与胆囊管囊肿及胆结石时，诊断效力要比CA19-9的诊断效力要高。Peak1在诊断胆管囊肿是的诊断效力较高。结论：peak10可能作为一种新的无创伤的胆管癌的诊断标志物，可以作为CA19-9的有力的补充，可以在CA19-9阴性的病人中提供一种新的诊断方式，并且可以为我们探索胆管癌的发生机制提供一定的启示，同时peak1也可以作为胆管囊肿的特异性诊断指标，为胆管囊肿的发生机制提供一定的帮助。第二部分：肝门部胆管癌大样本临床病例微小RNA的研究本研究从肝门部胆管癌患者血清microRNAs的变化分析入手，评估microRNAs图谱变化在肝门部胆管癌早期诊断的价值。根据以前文献资料的报道，我们遴选了5种与肝门部胆管癌相关的microRNAs：miR-21、miR-106a、miR-224、miR-224-2、miR-370作为研究对象，采用逆转录(Reverse Transcription,RT)和定量PCR(Quantitative PCR,(qPCR)的方法，检测了98例研究对象（44例肝门部胆管癌，24例胆管良性病,包括胆总管囊肿和胆囊炎，以及20例正常对照）的血清microRNAs的变化，比较肝门部胆管癌、胆管良性疾病与健康人之间的特征性改变，并用独立样本方差分析（one-wayANOVA）分析及LSD两两分析各来分析各个病种血清中microRNAs的表达差异，并用ROC曲线评估各指标的诊断效力。结果发现miR-21在胆管癌、胆管良性病及健康人血清中的表达有显著性差异（p=0.018），胆管癌与胆管良性病比较有显著性升高（p=0.016），与健康人比较有显著性升高（p=0.021），而胆管良性病与健康人之间表达无显著性差异；miR-106a在胆管癌、胆管良性病及健康人血清中的表达有显著性降低（p=0.044），在胆管癌与健康人血清相比较，表达有显著性降低（p=0.019），与胆管良性肿瘤比较未见显著性差异，胆管良性病与健康人比较未见显著性差异；miR-21及miR-106a在不同类型胆管癌患者及是否有淋巴转移的患者血清中的表达都没有显著性差异。miR-21在区分胆管癌和健康人时的ROC曲线下面积AUR=0.745，在区分胆管癌及胆道良性肿瘤时的ROC曲线下面积AUR=0.686。miR-106a miR-21在区分胆管癌和健康人时的ROC曲线下面积AUR=0.714。其余microRNAs在各组患者血清中表达未见显著性差异。结论：miR-21及miR-106a有望成为显得肝门部胆管癌诊断标记物，并且有可能用于肝门部胆管癌患者术后动态监测和疗效评价。综上所述，通过本课题的研究，我们发现异常岩藻糖基化和部分微小RNA与HCCA的发生发展密切相关；N-糖及微小RNA可作为特异性胆管癌标志物在原发性肝门部胆管癌早期诊断、动态监测、疗效评价中具有潜在的应用前景。