目的:评估脂质体转染的双链寡聚脱氧核苷酸(ds ODNs)竞争性抑制对肺泡巨噬细胞(AMs)中核因子-κB(NF-κB)与DNA结合活性的影响效能,确定脂质体转染dsODNs的最适浓度及最佳转染时间,验证dsODNs-decoy策略靶向封闭肺泡巨噬细胞中NF-κB信号通路的可行性,并探讨其抗炎作用机制。方法:在动物实验中取出家兔的支气管肺组织,用温生理盐水灌洗提取肺泡巨噬细胞,经提纯鉴定后,分对照组、LPS刺激组、Lipofectamine2000组和不同比例dsODNs-Lipofectamine2000组,分别给予不同处理后培养。各组在培养4 h、6 h、8 h三个时间点,用LDH试剂盒检测各组细胞培养上清液中LDH含量,了解不同处理对AMs的毒性损害;用共聚焦激光显微镜观察不同时间点及不同比例dsODNs-Lipofectamine2000组AMs中荧光分布情况;用流式细胞仪检测不同比例dsODNs-Lipofectamine2000组中AMs的荧光强度及细胞摄取率确定最佳转染条件;RT-PCR检测dsODNs转染后AMs中IL-1β、IL-6、TNF-α因子的mRNA表达;Western-blot检测ds ODNs-Lipofectamine2000转染后AMs内NF-κB p65亚基在细胞质及细胞核中的分布情况。结果:转染AMs的dsODNs-Lipofectamine2000浓度比为1:5时,LDH检测细胞毒性适中,转染效率最佳;从荧光强度、细胞状态及转染效率等方面综合分析,转染6 h为最佳时间;与LPS组比较,dsODNs-Lipofectamine2000组中IL-1β、IL-6、TNF-α炎症介质的mRNA表达均明显被抑制,差异具有统计学意义(P<0.05);Western-blot结果显示,经ds ODNs-Lipofectamine2000处理后,AMs细胞质中NF-κB p65亚基的表达明显多于细胞核中。结论:dsODNs-Lipofecetamine2000能在体外有效转染AMs,并成功抑制AMs中NF-κB相关炎性基因的转录表达;结果显示dsODNs-decoy策略可以抑制炎症效应细胞中NF-κB信号通路,用于临床治疗SIRS/ALI具有可行性。其作用机制除dsODNs可干扰NF-κB/DNA结合活性外,还可能通过抑制细胞质中的NF-κB与I-κB解离,从而抑制NF-κB活化,减少活化的NF-κB p65的入核,阻断NF-κB介导的炎症信号通路。
