枇杷糖代谢关键酶HXK基因家族生物信息学分析与功能验证

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己糖激酶是参与糖酵解第一步反应的不可逆酶,是糖代谢过程中的关键酶之一,具有催化己糖磷酸化的作用。本研究通过对RNA-seq测序获得的枇杷己糖激酶基因家族序列进行生物信息学分析,再将已分离克隆出的枇杷HXK基因遗传转化烟草,然后对获得的烟草转基因植株进行生理表型分析及糖含量测定,初步验证了枇杷己糖激酶的分子功能。主要研究结果如下:采用NCBI、ExPASy、Predictprotein等分析软件对RNA-seq测序获得的EjHXK基因家族进行生物信息学分析。序列分析显示,7条HXK基因序列均含有完整开放阅读框,编码497个氨基酸;蛋白分析显示,由它们所编码的蛋白相对分子质量均约为53kDa,理论等电点pI在6.1~6.8之间,具有1~2段跨膜区域,均属于亲水性的稳定膜蛋白,无信号肽;二级结构组成均以α-螺旋和无规则卷曲为主,且多肽链上存在多个半胱氨酸残基位点。蛋白保守结构域预测均包含核苷酸结合位点和同源二聚体界面;具有丰富的蛋白磷酸化结合位点和蛋白功能位点,预测分析两者均可能通过蛋白的磷酸化、糖基化、酰基化等蛋白翻译后修饰方式对蛋白结构和功能进行调控。利用DNAMAN、MEGA5.0等分析EjHXK基因家族序列同源进化关系显示,它们之间的同源性达95%~98%,与木本植物己糖激酶蛋白序列同源性较高,且蛋白功能域较保守。系统进化关系分析显示,己糖激酶在单子叶植物和双子叶植物中聚类分布没有明显的界限,而EjHXK基因与苹果、中国白梨及可可树等木本植物中己糖激酶亲缘进化关系接近。通过农杆菌介导法遗传转化烟草获得EjHXK转基因植株,对其T1代转基因植株进行生理形态观察测定,分析显示,与野生型烟草植株相比,过量表达EjHXK基因植株提早12~15d开花。利用HPLC测定分析不同时期EjHXK转基因烟草叶片糖含量,结果表明,转基因烟草和野生型烟草中葡萄糖和果糖含量均随植株生长而逐渐增加,当达到花期时出现最高值,而后随着植株成熟衰老其含量不断下降,其中蔗糖含量变化趋势不明显,含量偏低。以野生型烟草作对照,可发现转入EjHXK烟草在生长周期内各糖含量均有下降趋势,对于同一生长阶段存在0.5~1.0mg/mL的降低。转基因植株和野生型植株总糖含量分别于75d和90d左右时出现最高值,即开花期,这与表型观察记录变化趋势相同。由此验证了枇杷己糖激酶能够催化己糖磷酸化,参与调控糖代谢过程,促进植株生长发育。本试验通过基因及蛋白序列分析和遗传转化研究,初步鉴定了枇杷EjHXK基因功能,研究结果为枇杷糖代谢的深入研究提供了理论基础。
摘要第4-6页
ABSTRACT第6-7页
引言第11-12页
1 文献综述第12-25页
    1.1 果实糖代谢的研究进展第12-18页
        1.1.1 果实中糖组分及积累类型第12-13页
        1.1.2 果实糖代谢相关酶的反应及调控途径第13-14页
        1.1.3 几种典型果树果实糖代谢研究第14-18页
    1.2 植物HXK国内外研究进展第18-21页
        1.2.1 植物HXK简介第18页
        1.2.2 植物HXK存在形式与分类第18-19页
        1.2.3 植物HXK基因家族第19页
        1.2.4 植物HXK基因分离与克隆第19-20页
        1.2.5 植物HXK基因表达分析及转基因功能验证的研究第20-21页
    1.3 生物信息学分析研究进展概述第21-23页
        1.3.1 生物信息学概述第21页
        1.3.2 生物信息学数据库第21-22页
        1.3.3 序列分析与相关软件第22页
        1.3.4 植物HXK基因生物信息学分析研究第22-23页
    1.4 研究目的及内容第23-25页
        1.4.1 研究目的意义第23页
        1.4.2 主要研究内容第23-25页
2 枇杷HXK基因家族生物信息学分析第25-38页
    2.1 试验设计与方法第25-26页
        2.1.1 枇杷HXK基因家族序列的获得第25页
        2.1.2 枇杷HXK基因序列相似性比较及蛋白多序列比对第25页
        2.1.3 枇杷HXK基因及蛋白序列特性预测第25-26页
        2.1.4 枇杷HXK蛋白二级结构及保守域的预测第26页
        2.1.5 枇杷HXK氨基酸同源性比较及系统进化树的构建第26页
    2.2 结果与分析第26-36页
        2.2.1 枇杷HXK基因家族成员的获得及比较分析第26-30页
        2.2.2 枇杷HXK基因及蛋白序列特性分析第30-33页
            2.2.2.1 枇杷HXK核苷酸及氨基酸基本理化性质分析第30页
            2.2.2.2 枇杷HXK蛋白亲/疏水性预测分析第30-31页
            2.2.2.3 枇杷HXK蛋白跨膜区域预测分析第31-32页
            2.2.2.4 枇杷HXK蛋白信号肽预测第32-33页
        2.2.3 枇杷HXK蛋白二级结构的预测分析第33页
        2.2.4 枇杷HXK氨基酸序列保守结构域的预测分析第33页
        2.2.5 枇杷HXK蛋白磷酸化位点及功能位点的预测分析第33-34页
            2.2.5.1 枇杷HXK蛋白磷酸化位点预测分析第33-34页
            2.2.5.2 枇杷HXK蛋白功能位点预测分析第34页
        2.2.6 HXK氨基酸序列同源性和进化分析第34-36页
    2.3 讨论第36-38页
        2.3.1 植物HXK基因及编码蛋白的理化特性第36页
        2.3.2 枇杷HXK有明确的参与糖代谢的功能域第36-37页
        2.3.3 枇杷HXK基因与家族其他成员间同源进化关系密切第37-38页
3 枇杷EJHXK遗传转化烟草及功能的初步验证第38-51页
    3.1 农杆菌介导法转化烟草第38-40页
        3.1.1 试验材料、试剂及仪器设备第38页
            3.1.1.1 植物材料第38页
            3.1.1.2 主要实验试剂第38页
            3.1.1.3 主要实验仪器设备第38页
        3.1.2 试验设计与方法第38-40页
            3.1.2.1 无菌外植体的获得第38-39页
            3.1.2.2 烟草外植体对潮霉素的浓度筛选第39页
            3.1.2.3 烟草叶片的遗传转化过程第39-40页
    3.2 转基因植株的检测第40-42页
        3.2.1 试验材料、试剂及仪器设备第40页
            3.2.1.1 植物材料第40页
            3.2.1.2 试验主要试剂第40页
            3.2.1.3 试验主要仪器第40页
            3.2.1.4 PCR引物设计第40页
        3.2.2 试验设计与方法第40-42页
            3.2.2.1 烟草叶片DNA的提取第40-41页
            3.2.2.2 转化烟草植株的PCR分子检测第41-42页
    3.3 枇杷EJHXK基因在转基因烟草中功能的初步鉴定第42-43页
        3.3.1 试验材料、试剂和仪器第42页
            3.3.1.1 植物材料第42页
            3.3.1.2 试验主要试剂第42页
            3.3.1.3 试验主要仪器第42页
        3.3.2 试验设计与方法第42-43页
            3.3.2.1 转基因植株与非转基因植株生理、形态比较第42页
            3.3.2.2 转基因植株发育过程中糖含量的提取测定第42-43页
    3.4 结果与分析第43-50页
        3.4.1 潮霉素使用浓度的确定第43-44页
        3.4.2 烟草的转化与抗性植株筛选第44-45页
        3.4.3 转基因植株DNA提取分析第45-46页
        3.4.4 转基因植株PCR检测分析第46页
        3.4.5 转基因植株与非转基因植株生理、形态比较分析第46-48页
            3.4.5.1 T1代转基因烟草植株的PCR检测第46-47页
            3.4.5.2 T1代转基因烟草植株与野生型植株的生理、形态差异分析第47-48页
        3.4.6 转基因植株发育过程中糖含量测定分析第48-50页
            3.4.6.1 糖标准溶液HPLC测定第48-49页
            3.4.6.2 烟草叶片中各糖的动态分析第49-50页
    3.5 讨论第50-51页
4 结语第51-52页
参考文献第52-58页
附录第58-59页
个人简介第59-60页
致谢第60页
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