枯草芽孢杆菌E1R-j产抗菌脂肽的发酵条件优化及分离纯化

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）能够产生多种抗菌物质，包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类和核酸类等多种化合物，这些抗菌物质能抑制真菌、细菌、病毒和菌原体等的正常生长，在植物病害防治方面具有重要的应用价值。而防治植物病害的主要活性物质是脂肽类化合物，但由于其产量不高使其应用受到限制。本研究利用一株分离自小麦根部的内生枯草芽孢杆菌E1R-j，前期试验发现，其无菌发酵滤液对小麦全蚀菌、苹果腐烂菌、小麦赤霉菌、番茄早疫菌等均具有很好的抑制作用，同时也对小麦全蚀菌具有很好的大田防治效果，为了使该菌株在生产实践中得到推广和工业化应用，本研究利用单因素和响应面法相结合的方法，以粗脂肽物质的产量为指标，对其发酵条件进行优化，同时通过质谱鉴定进一步明确具有抑菌活性物质的分子量大小。得到以下结果：1.通过优化过程中的单因素试验结果表明，温度、培养基初始pH、接种量、装液量和转速对枯草芽孢杆菌E1R-j在Landy培养基中的脂肽类物质产量均有显著影响。在单因素筛选出的因素及水平的基础上，利用响应面法确定其最佳发酵条件为：温度40℃，培养基初始pH9.0，接种量3.0%，装液量50mL，转速200rpm。在优化后的发酵条件下培养，粗脂肽物质浓度达1.39g/L，是原发酵条件下0.55g/L的2倍多，极大的提高了粗脂肽物质的产量。2.脂肽物质纯化后共得到四个组分P1、P2、P3和P-4，它们的抑菌活性大小和抑菌谱各不相同，其中P1对小麦全蚀菌和番茄早疫菌有较好的抑制效果，P2只对小麦全蚀菌有较好的抑制效果，二者的抑菌活性均小于P3；P3的抑菌活性最大，且对供试的小麦全蚀菌、苹果腐烂菌、番茄灰霉菌和番茄早疫菌都有很好的抑制效果；P4只对小麦全蚀菌和番茄早疫菌有微弱的抑制效果。3.通过MODI-TOF-TOF/MS质谱鉴定，P1物质组分复杂，未得到有效纯化；P2分子量为915.5576Da；P3是分子量分别为1477.846Da，1491.898Da，1505.960Da和1513.964Da，1527.992Da的两组同系物；P4是分子量为901.6007Da，915.6376Da和902.5656Da，916.5887Da的两组同系物。4.以小麦全蚀菌为靶标菌，研究表明P3在80℃121℃的高温处理后与25℃下的抑菌效果无显著差异，其对温度不敏感；P3对蛋白酶K具有稳定性并且能在不同的有机溶剂甲醇、乙腈、丙酮中均保持活性，但在甲醇中的活性最高。