激活NF-κB信号通路的高致病性PRRSV非结构蛋白的筛选及其作用机制研究

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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍、仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的一种新发性病毒传染病。PRRSV基因组为不分节段的单股正链RNA,可编码14种非结构蛋白和7种结构蛋白,其中Nsp2是分子量最大且最易发生变异的一个病毒编码蛋白。2006年,由PRRSV变异株引起的高致病性PRRS在我国大规模暴发,造成上百万头猪死亡,给我国养猪业带来了巨大的经济损失。与传统的PRRSV毒株相比,高致病性PRRSV毒株能够引起更强烈的炎症反应和更高的死亡率,并成为我国流行和蔓延的主要毒株。然而,目前对这种毒株感染后引起宿主细胞的信号转导机制知之甚少。针对这种新的PRRSV,本文开展了对其诱导机体产生炎症反应的信号转导机制研究,为阐明PRRSV的致病机理提供理论依据。具体研究内容包括:1.高致病性PRRSV感染激活NF-κB信号通路的研究NF-κB是一类具有多重转录调节作用的核蛋白因子,在炎症反应、免疫反应和细胞的增殖中都有着重要的作用。利用NF-κB荧光素酶报告系统检测高致病性PRRSV对NF-κB的激活情况,发现其能显著激活NF-κB并依赖于病毒的复制,且呈剂量依赖性。进一步以PRRSV感染MARC-145细胞,检测细胞内TLR信号通路的关键接头蛋白及重要信号分子的表达情况,对PRRSV激活NF-κB的分子机制进行了初步探究。结果表明,PRRSV能上调病原模式识别受体TLR2和TLR4以及信号分子TRAF6和TAK1的表达,推测PRRSV通过同时上调模式受体TLR2和TLR4进而上调信号分子TRAF6和TAK1的表达从而激活NF-κB信号通路;同时还发现PRRSV感染的MARC-145细胞内TLR3和其他的信号蛋白并无显著上调,甚至部分细胞因子在某些时间点还出现表达下调的趋势。这提示着PRRSV在感染细胞内调控信号传导途径的复杂性,其可能是通过多种调控策略调控NF-κB的上游信号通路,而最终导致NF-κB活化的。这些结果为解释临床上PRRSV引起复杂的机体免疫反应和强烈的炎症反应补充了有用的数据。2.激活NF-κB信号通路的高致病性PRRSV非结构蛋白的筛选已有研究表明,PRRSV编码的所有结构蛋白中,N蛋白能显著激活NF-κB。为了阐明PRRSV编码的非结构蛋白在其诱导NF-κB活化中的作用,利用NF-κB荧光素酶报告系统,对高致病性PRRSV所有非结构蛋白激活NF-κB的能力进行研究,发现只有Nsp2能显著激活NF-κB,而其他的非结构蛋白对NF-κB无明显激活。3.高致病性PRRSV Nsp2激活NF-κB信号通路的分子机制研究为了解析Nsp2激活NF-κB的分子机制,首先以Nsp2的真核表达质粒转染细胞,检测IκBα和NF-κB下游炎症细胞因子的表达及NF-κB p65的磷酸化和转定位情况,发现Nsp2能诱导IκBα的降解及p65的磷酸化和转核,并激活NF-κB下游炎症细胞因子。进一步利用Nsp2截短突变体的真核表达质粒,证实Nsp2激活NF-κB的作用域位于高变区的180-480位氨基酸之间。通过对Nsp2跨膜结构域的预测和跨膜区缺失突变体的荧光素酶实验,发现其C端的跨膜结构在其细胞定位以及激活NF-κB中均发挥重要作用,推测其线粒体定位可能为其激活NF-κB所必需。进一步利用RNA干扰实验和Nsp2超表达对Nsp2诱导NF-κB的上游信号通路进行了探究,结果表明,接头蛋白TLR4和信号分子TRIF、MAVS的沉默可以抑制Nsp2对NF-κB的激活;而Nsp2的超表达可以上调TLR4、TRIF以及TRAF2的表达。这些结果表明,PRRSV Nsp2可能是同时通过TLR4和RIG-1依赖的信号途径激活NF-κB。由于RIG-1信号通路中的重要接头蛋白MAVS是一个线粒体定位蛋白,而Nsp2的线粒体定位模式改变后其激活NF-κB的能力显著降低,这说明Nsp2与MAVS的共定位对Nsp2激活NF-κB具有重要的作用。4.Nsp2与宿主蛋白RAI相互作用激活NF-κB的研究由于病毒感染动物机体后与宿主的相互作用是其致病的分子基础,本研究又从蛋白相互作用的角度对Nsp2激活NF-κB的可能机制进行探究。首先运用酵母双杂交技术从猪脑cDNA文库中筛选了与PRRSV Nsp2相互作用的宿主蛋白,并选取能与p65结合从而特异性抑制NF-κB转录活性的宿主蛋白RAI作为深入研究的对象。进一步,通过哺乳动物双杂交系统、免疫共沉淀技术、荧光共定位等实验证实了Nsp2与RAI在哺乳动物细胞内的相互作用。并利用截短突变体和酵母回返实验,确定了二者相互作用的功能域分别位于Nsp2中间的高变区和RAI的C端,由于RAI与p65的互作区域同样位于C端,推测当PRRSV感染细胞后,其编码的Nsp2可能通过与RAI相互作用从而拮抗RAI对NF-κB的抑制作用,为了验证这一推测,利用NF-κB启动子的荧光素酶报告系统检测了Nsp2与RAI相互作用对NF-κB表达的影响,结果超表达RAI显著抑制NF-κB的启动子活性,而同时超表达Nsp2与RAI时不影响NF-κB的启动子活性;进一步检测Nsp2对RAI表达水平的影响,发现Nsp2对RAI的表达水平无明显影响,这表明Nsp2拮抗RAI的NF-κB抑制功能并不是通过降低其表达水平来完成的,这也进一步证实Nsp2可能是通过拮抗RAI与p65的相互作用从而激活NF-κB的。5. PRRSV经典株与变异株引起不同程度炎症反应的分子机理研究通过比较PRRSV经典毒株CH-1a与变异毒株WUH3的Nsp2激活NF-κB的能力,发现WUH3株的Nsp2激活NF-κB的能力显著高于CH-1a株的Nsp2。由于变异毒株与经典毒株Nsp2的主要差异是中间高变区内存在30个氨基酸的不连续缺失,为了探究30个氨基酸的缺失是否是造成二者激活NF-κB能力差异显著的原因,构建了一系列Nsp2的插入和缺失突变体,并通过荧光素酶报告系统检测其激活NF-κB的能力。结果显示,1个或29个氨基酸的缺失并不是造成二者激活NF-κB能力差异的直接原因。进一步,通过荧光素酶报告系统对两种毒株的Nsp2及其突变体激活IL-6、IL-8、RANTES等炎症细胞因子的能力进行了比较,发现两种毒株的Nsp2激活IL-6、IL-8、RANTES的能力均存在显著差异,变异株的Nsp2的激活能力显著高于经典株的Nsp2,而1个或29个氨基酸的缺失并不是造成此种差异的直接原因。由于核转录因子NF-κB与炎性细胞因子IL-6、IL-8、RANTES都是参与机体炎症反应的重要细胞因子,因此以上结果为解释临床上不同毒株引起不同程度的炎症反应奠定了一定的理论基础。
摘要第8-11页
Abstract第11-13页
縮略语表(Abbreviation)第14-17页
第1章 文献综述第17-36页
    1.1 猪繁殖与呼吸综合征第17-18页
        1.1.1 PRRS的流行病学特征第17页
        1.1.2 PRRS的临床症状第17-18页
    1.2 PRRSV 病原学特性第18-19页
        1.2.1 PRRSV 的分类第18页
        1.2.2 PRRSV 的理化特性第18页
        1.2.3 PRRSV 的抗原性第18页
        1.2.4 PRRSV 的体外生长特性第18-19页
        1.2.5 PRRSV 的致病机理第19页
        1.2.6 PRRSV 的生物学特性第19页
    1.3 PRRSV 基因组结构特征第19-22页
        1.3.1 PRRSV 基因组第19-20页
        1.3.2 PRRSV 编码的非结构蛋白第20-21页
        1.3.3 PRRSV 编码的结构蛋白第21页
        1.3.4 PRRSV 的基因组变异第21-22页
        1.3.5 PRRSV 不同毒株的毒力差异第22页
    1.4 Toll样受体第22-25页
        1.4.1 Toll样受体概况第22-23页
        1.4.2 Toll样受体在免疫学中的作用第23页
        1.4.3 TLR的信号传导途径第23-25页
    1.5 NF-κB信号转导途径第25-31页
        1.5.1 NF-κB系统第25-28页
        1.5.2 NF-κB激活的分子机制第28-29页
        1.5.3 NF-κB激活的上游信号途径第29-31页
    1.6 PRRSV 与炎症反应第31-33页
        1.6.1 炎性细胞因子第32页
        1.6.2 NF-κB和炎症反应第32页
        1.6.3 PRRSV 诱导的炎症反应第32-33页
    1.7 研究蛋白质与蛋白质相互作用的方法第33-36页
        1.7.1 酵母双杂交系统第33-35页
        1.7.2 哺乳动物双杂交系统第35页
        1.7.3 免疫共沉淀技术第35页
        1.7.4 其他检测蛋白-蛋白相互作用技术第35-36页
第2章 研究目的与意义第36-37页
第3章 材料与方法第37-55页
    3.1 试验材料第37-44页
        3.1.1 细胞、毒株与菌株第37页
        3.1.2 载体与质粒第37-39页
        3.1.3 工具酶及主要试剂第39-40页
        3.1.4 Western Blot及CO-IP所需材料第40页
        3.1.5 培养基与抗生素及其配制第40-41页
        3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制第41-43页
        3.1.7 主要实验仪器及设备第43-44页
        3.1.8 分子生物学分析软件第44页
    3.2 试验方法第44-55页
        3.2.1 PRRSV 的增殖及紫外灭活第44页
        3.2.2 半数细胞培养物感染量(TCID_(50))的测定第44页
        3.2.3 RNA的提取及RT-PCR扩增目的片段第44-45页
        3.2.4 PCR产物的纯化第45-46页
        3.2.5 限制性内切酶酶切反应第46页
        3.2.6 PCR产物或酶切产物的电泳检测第46页
        3.2.7 酶切产物回收与纯化第46页
        3.2.8 DNA片段与质粒载体的连接反应第46-47页
        3.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)第47页
        3.2.10 连接产物的转化第47页
        3.2.11 质粒的制备与鉴定第47-48页
        3.2.12 质粒转染(脂质体介导转染法)第48-49页
        3.2.13 Western Blot检测目的蛋白在真核细胞中的表达第49-50页
        3.2.14 免疫共沉淀第50-51页
        3.2.15 SYBR Green Ⅰ实时定量PCR第51页
        3.2.16 相对mRNA表达水平的计算第51页
        3.2.17 双荧光素酶检测实验第51-52页
        3.2.18 DAPI染色第52页
        3.2.19 酵母双杂交筛选互作蛋白第52-53页
        3.2.20 阳性克隆的初步鉴定第53-54页
        3.2.21 酵母回返试验对蛋白互作的验证第54页
        3.2.22 激光共聚焦显微镜观察第54页
        3.2.23 统计学方法第54-55页
第4章 结果与分析第55-107页
    4.1 高致病性PRRSV 感染激活NF-κB信号通路的分子机制研究第55-59页
        4.1.1 PRRSV 的扩增及TCID_(50)的测定第55页
        4.1.2 PRRSV 感染显著激活NF-κB第55-56页
        4.1.3 PRRSV 感染激活NF-κB上游信号通路的研究第56-59页
    4.2 激活NF-κB信号通路的高致病性PRRSV 非结构蛋白的筛选第59-62页
        4.2.1 PRRSV 非结构蛋白真核表达质粒的构建第59-61页
        4.2.2 激活NF-κB的PRRSV 非结构蛋白的筛选第61-62页
    4.3 高致病性PRRSV Nsp2激活NF-κB信号通路的分子机制研究第62-83页
        4.3.1 Nsp2在MARC-145和HeLa细胞中激活NF-κB均呈剂量依赖性第62-63页
        4.3.2 Nsp2诱导IκB的降解以及p65的磷酸化和转核第63-65页
        4.3.3 Nsp2显著激活NF-κB信号通路下游的多个细胞因子第65-66页
        4.3.4 Nsp2激活下游细胞因子依赖于NF-κB信号通路第66-68页
        4.3.5 Nsp2激活NF-κB的功能域的确定第68-75页
        4.3.6 Nsp2亚细胞定位的确定第75-76页
        4.3.7 Nsp2 C端跨膜结构与其定位及功能的关系第76-80页
        4.3.8 Nsp2激活NF-κB上游信号通路的研究第80-83页
    4.4 Nsp2与RAI相互作用激活NF-κB的研究第83-101页
        4.4.1 酵母双杂交技术筛选与Nsp2相互作用的宿主蛋白第83-87页
        4.4.2 酵母回返实验验证Nsp2与RAI的互作第87-90页
        4.4.3 Nsp2和RAI相互作用的体内验证第90-96页
        4.4.4 Nsp2和RAI相互作用区域的确定第96-100页
        4.4.5 Nsp2拮抗RAI对NF-κB的抑制作用第100-101页
        4.4.6 Nsp2对RAI表达水平的影响第101页
    4.5 PRRSV 经典株与变异株引起不同程度炎症反应的分子机理研究第101-107页
        4.5.1 不同毒株来源的Nsp2激活NF-κB的能力比较第101-102页
        4.5.2 不同毒株来源Nsp2激活NF-κB能力差异的原因分析第102-105页
        4.5.3 不同毒株来源Nsp2激活炎症因子的能力分析第105-107页
第5章 讨论与结论第107-114页
    5.1 讨论第107-112页
        5.1.1 PRRSV 激活NF-κB信号通路的分子机制第107-108页
        5.1.2 PRRSV Nsp2激活NF-κB的信号途径第108-110页
        5.1.3 Nsp2与宿主蛋白的相互作用及其生物学功能第110-111页
        5.1.4 Nsp2蛋白的变异与病毒毒力的关系第111-112页
    5.2 结论第112-114页
参考文献第114-128页
致谢第128-129页
附录第129-130页
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论文编号ABS548583,这篇论文共130页
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