副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, H. parasuis)引起的H. parasuis病在世界上多个国家广泛存在,已成为危害全球养猪业发展的一种重要细菌性疾病。近年来,H. parasuis病在我国的发病率越来越高,已先后在全国多个省市发病,给我国的养猪业造成了一定的危害。H. parasuis的血清型复杂多样,除已确定的15个血清型外还有大量未定型菌株,且各血清型之间的致病力也存在极大的差异。一般认为,血清1、2、4、5、8、10、12、13、14和15型为毒力血清型,而血清3、6、7、9、和11型为非毒力血清型。虽然H. parasuis的基因组已经公布(GenBank: Acc. CP001321; GenBank Acc. ABKM00000000),但是关于H. parasuis的毒力因子目前还知之甚少。革兰氏阴性菌的外膜蛋白与细菌的致病性和免疫原性的相关性研究已取得了很大进展,因而,H. parasuis外膜蛋白与其毒力的研究也受到人们的重视。已证实与H. parasuis同属的流感嗜血杆菌的外膜蛋白P2(ompP2)是该菌的一个毒力因子。但H. parasuis的ompP2基因是否与流感嗜血杆菌的ompP2基因一样是一个毒力因子,有待进一步研究。本研究旨在进一步对H. parasuis ompP2基因的结构特点进行分析,并比较不同结构特点的ompP2基因对细胞的毒性作用,从而对H. parasuis ompP2基因的生物学功能进行探索,取得的结果如下:1 H. parasuis ompP2基因的结构特点1.1 H. parasuis ompP2基因存在两种结构类型本研究对H. parasuis15个血清型的参考菌株和分离自患H. parasuis病病死猪实质器官的19株临床分离株的ompP2基因进行了克隆分析。结果显示,在15个血清型的参考菌株中ompP2基因长为1077～1203 bp,编码氨基酸长度为358～400个氨基酸残基,编码蛋白大小为38.49～43.35kDa;除血清1、8型参考菌株外,与无毒血清型(3、6、7、9、11)参考菌株相比,毒力血清型(2、4、5、10、12、13、14、15)参考菌株的ompP2基因都存在两段连续碱基缺失。这两段碱基缺失分别存在于450～524bp和770～844bp范围内,共计100bp左右;同时该基因在不同血清型中还存在较多的点突变。在19株临床分离株中ompP2基因长为1080～1086 bp,预测编码的氨基酸长度为358～361个氨基酸残基,编码蛋白大小38.38～38.91kDa。值得一提的是,这些临床分离株与毒力菌株一样存在相同的两段连续碱基缺失。1.2 H. parasuis ompP2基因编码的蛋白在不同菌株中其结构存在差异使用PRED-TMBB软件(http://bioinformatics. biol. uoa. gr/PRED-TMBB/)和http://bio.dfci.harvard. edu/Tools/antigenic.pl对H. parasuis ompP2基因所编码蛋白的跨膜结构以及表面暴露环的特点分析发现, 19株临床分离株以及血清2、4、5、10、12、13、14和15型参考菌株都具有8个表面暴露环,而血清1、3、6、7、8、9和11型则具有9个表面暴露环,前者在Loop4和Loop5之间缺失了一个Loop9。分析19株临床分离株及15株参考菌株ompP2基因编码的暴露于膜外的抗原决定簇,在19株临床分离株中为5个,参考菌株中血清1、5、8、13、14和15型为5个;2型为7个;3、4、10和12型为6个;6、7和9型为4个;11型为3个。有趣的是,ompP2基因两处碱基的连续缺失反而会使其暴露于膜外抗原决定簇个数的增加。虽然血清1、8型参考株ompP2基因为不缺失型,但其暴露于膜外抗原决定簇个数为5个。一般认为的毒力血清型1、2、4、5、8、10、12、13、14和15中ompP2基因暴露在膜外的抗原决定簇个数(5～7),多于非毒力血清型6、7、9和11的暴露在膜外的抗原决定簇个数(3～4)。在19株临床分离株和所有的毒力参考菌株中均存在一个非毒力菌株所没有的膜表面抗原决定簇VTDQ(K)ALGVGL,位于Loop8中。此外,除血清1型和8型参考菌株外,所有的临床分离株和毒力参考菌株均存在一个表面抗原决定簇EKIDFVRT,位于Loop4中。2 H.parasuis ompP2基因的结构特点与毒力的联系本研究构建了H. parasuis的ompP2基因的两种基因结构类型的真核表达载体,并用构建好的载体转染Marc-145细胞,通过观察转染后Marc-145细胞形态的变化,对两种不同结构类型的ompP2基因与H. parasuis毒力的联系进行研究。实验结果表明不同结构的ompP2基因对Marc-145细胞的细胞毒性存在明显的差异,血清5型ompP2蛋白对Marc-145细胞有明显的细胞毒性作用,且随着转染中质粒剂量的增加,对细胞的毒性作用也随之增加,表现出明显的量效关系;而血清11型的ompP2基因在相同剂量和转染条件下对Marc-145细胞没有明显的细胞毒性作用。本实验首次证明H.parasuis ompP2基因结构特征与毒力的关系,碱基连续缺失的ompP2基因是H.parasuis的一个毒力基因。3 H. parasuis ompP2基因DNA疫苗具有一定的保护作用应用本研究制备的H.parasuis ompP2基因DNA疫苗(PcDNA3-ompP2-5)免疫雄性Balb/c小鼠,免疫后人工感染H.parasuis血清5型菌株,结果显示,当免疫剂量为150μg/只和添加有603佐剂的100μg/只时,DNA疫苗能够推迟H.parasuis感染后小鼠的死亡时间,说明该疫苗具有一定的免疫保护作用。4 H. parasuis ompP2基因和16SrRNA基因的双重PCR方法的建立本研究设计了一对扩增H. parasuis ompP2基因中碱基缺失区域的特异性引物,并用该引物对15个血清型参考菌株和81株临床分离株进行了检测,结果显示在所有临床分离株中都存在两段连续的碱基缺失。将扩增ompP2基因碱基缺失区域的特异性引物和16SrRNA基因引物的浓度和PCR反应条件进行优化,并用该方法对H. parasuis的15株参考菌株和81株临床分离株进行检测。由于16SrRNA引物可以特异性地鉴定H. parasuis,而针对H. parasuis ompP2基因中碱基缺失区域的特异性引物可以区分不同菌株的ompP2基因是否缺失部分区域,因此这两对引物的联合使用有望建立一种基于靶向ompP2和16SrRNA基因的用以区分毒力和无毒的H. parasuis菌株(血清1和8型除外)的双重PCR检测方法。
