变性剂诱导的猪胃蛋白酶和牛血清蛋白去折叠过程及温度诱导的牛血清蛋白构象过渡的研究

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论文主要研究了脲和盐酸胍诱导的猪胃蛋白酶和牛血清蛋白去折叠过程中各稳定构象态的分布和过渡,以及不同温度下牛血清蛋白构象变化和在反相色谱柱上的吸附作用。1.利用紫外和荧光光谱测定了不同浓度脲和盐酸胍诱导的猪胃蛋白酶和牛血清蛋白的残余活性,并获得两个描述它们去折叠过程中各稳定构象态之间过渡的特征展开参数K和△m。脲诱导的猪胃蛋白酶二态去折叠过程的特征展开参数△m、K分别为5.146、0.0095,盐酸胍诱导的猪胃蛋白酶三态去折叠过程的特征展开参数△m1、△m2、K1、K2分别为1.335、1.913、0.438、0.113,脲诱导的牛血清蛋白三态去折叠过程的特征展开参数△m1、△m2、K1、K2分别为1.76、1.80、0.78、0.41,而盐酸胍诱导的牛血清蛋白四态去折叠过程的特征展开参数△m1、△m2、△m3、K1、K2、K3分别为0.83、0.81、0.97、0.93、4.12、0.59:2.利用这两个参数探讨了脲和盐酸胍诱导的猪胃蛋白酶和牛血清蛋白各稳定构象态随变性剂浓度的分布和过渡。结果表明,在盐酸胍诱导的猪胃蛋白酶三态去折叠过程中,当盐酸胍浓度约为1.5mol/L时,折叠中间态的浓度达到最大,约占溶液中总猪胃蛋白酶的12%;在脲诱导的牛血清蛋白三态去折叠过程中,当脲浓度约为2.0mol/L时,折叠中间态的浓度达到最大,约占溶液中总牛血清蛋白的41%;在盐酸胍诱导的牛血清蛋白四态去折叠过程中,当盐酸胍浓度约为0.4和1.2mol/L时,第一和第二折叠中间态浓度达到最大,分别约占溶液中总牛血清蛋白的20%和70%;3.反相液相色谱研究中温度对牛血清蛋白构象变化的结果表明,温度在12~20℃变化范围内,牛血清蛋白仅以一种构象态A存在;温度在22~50℃变化范围内,牛血清蛋白以A、B两种不同的构象态存在,并且随着温度的升高A的含量逐渐减少,而B的含量逐渐增多。当温度达到50℃时构象态B占总牛血清蛋白的25%;4.根据牛血清蛋白在反相液相色谱柱上的保留行为确定了牛血清蛋白两种构象态在反相色谱柱上的吸附作用。结果表明,在牛血清蛋白从构象态A到B的转变过程中,△H>0、△S>0、△G>0,构象转变过程是熵驱动的非自发过程。当构象态A吸附时△H<0、△S<0、△G<0,而当构象态B吸附时△H<0、S>0、△G<0,表明构象态A和B在反相柱上的吸附作用都是自发的,且前者主要是由焓驱动的,而后者是由焓、熵共同驱动的。
摘要第3-5页
ABSTRACT第5-6页
第一章 绪论第10-16页
    1.1 蛋白质折叠的研究概况第11-14页
        1.1.1 研究背景第11-12页
        1.1.2 蛋白质的去折叠和重折叠第12-13页
        1.1.3 蛋白质分子中间态的研究第13页
        1.1.4 蛋白质折叠的热力学与动力学机制第13-14页
    1.2 蛋白质分子折叠过程的研究现状第14页
    1.3 本论文的主要工作及意义第14-16页
        1.3.1 本论文的研究基础第14-15页
        1.3.2 本论文的主要工作第15页
        1.3.3 本论文的研究意义第15-16页
第二章 变性剂诱导的猪胃蛋白酶和BSA去折叠过程残余活性的测定第16-23页
    2.1 理论基础第16-17页
        2.1.1 紫外-可见吸收光谱法第16页
        2.1.2 荧光光谱法第16页
        2.1.3 蛋白质与药物作用结合参数的测定第16-17页
        2.1.4 研究对象简介第17页
    2.2 仪器和试剂第17-18页
        2.2.1 实验试剂第17-18页
        2.2.2 实验仪器第18页
    2.3 实验方法第18-19页
        2.3.1 猪胃蛋白酶活性的测定第18页
        2.3.2 BSA活性的测定第18-19页
        2.3.3 猪胃蛋白酶去折叠过程残余活性率的测定第19页
        2.3.4 BSA去折叠过程残余活性率的测定第19页
    2.4 实验结果与讨论第19-22页
        2.4.1 猪胃蛋白酶的活性第19页
        2.4.2 BSA的活性第19-20页
        2.4.3 猪胃蛋白酶去折叠过程的残余活性率第20-21页
        2.4.4 BSA去折叠过程的残余活性率第21-22页
    2.5 本章小结第22-23页
第三章 变性剂诱导的猪胃蛋白酶和BSA去折叠过程各稳定构象态的分布第23-37页
    3.1 理论基础第23-28页
    3.2 猪胃蛋白酶去折叠过程的特征参数K和△m第28-30页
    3.3 BSA去折叠过程的特征参数K和Am第30-33页
    3.4 蛋白质去折叠过程各稳定构象态的分布第33-36页
    3.5 本章小结第36-37页
第四章 温度对BSA构象变化的影响第37-44页
    4.1 实验试剂与仪器第37页
        4.1.1 实验试剂第37页
        4.1.2 实验仪器第37页
    4.2 实验方法第37-38页
        4.2.1 反相液相色谱第37-38页
        4.2.2 SDS-PAGE电泳第38页
    4.3 结果与讨论第38-43页
    4.4 本章小结第43-44页
第五章 BSA两种构象态在反相色谱柱上的吸附作用第44-54页
    5.1 理论基础第44页
    5.2 温度在12~20℃之间BSA吸附作用的焓变和熵变第44-45页
    5.3 温度在22~50℃之间BSA吸附作用的焓变和熵变第45-47页
    5.4 BSA构象转变的焓变和熵变第47-51页
    5.5 BSA构象转变的焓-熵互补第51-53页
    5.6 BSA吸附和构象转变的自由能变第53页
    5.7 本章小结第53-54页
结论第54-55页
参考文献第55-61页
致谢第61页
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