枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达
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纤维素酶是一组复合酶的统称,主要包括内切葡聚糖酶,外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,这三种酶协同作用将纤维素转化成葡萄糖。近年来随着纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用,细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。然而,纤维素酶的大规模工业化应用在很大程度上受纤维素酶酶活较低以及成本较高的限制。通过基因工程手段,提高纤维素酶的活性是降低纤维素酶成本的一个有效途径。本研究以枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因为目的基因(GenBank Accession No.DQ782954),从信号肽切割位点序列之后设计上游引物(引入一个BglⅡ酶切位点),在终止密码子处设计下游引物(引入一个SphⅠ酶切位点),通过PCR去除该基因信号肽编码序列,PCR扩增得到大小约1.5Kb的单一条带产物,即为目的基因片段。该产物经酶切处理后连接到巨大芽孢杆菌表达载体pHIS1525中,并转化巨大芽孢杆菌WH320原生质体,使之在表达载体自身信号肽的引导下进行融合表达。刚果红染色表明该基因在巨大芽孢杆菌中得到了有效表达,且产物具有内切葡聚糖酶活性。SDS-PAGE分析表明该酶相对分子量约为55KDa。对基因工程菌pHBM-End培养条件优化结果表明:250mL三角瓶中装入50mL LB培养基(含有10μg/mL Tet),按5%的接种量接种种龄为12h的液体种子,培养4h后加入终浓度为0.2%的木糖进行诱导,9h后上清液中酶活可达889U/mL,是出发菌株C-36(79.2U/mL)的11.22倍。酶学性质研究表明,基因工程菌所产内切葡聚糖酶的最适反应pH值和温度分别为pH6.0、65℃,该酶在40℃~75℃之间相对稳定,可保持在最高酶活的70%以上,在pH4.5~pH10.0之间相对稳定,可保持在最高酶活的80%以上。
摘要 | 第4-5页 |
Abstract | 第5页 |
前言 | 第8页 |
1 芽孢杆菌表达系统的研究进展 | 第8-16页 |
1.1 芽孢杆菌基因表达的一般特点 | 第9-12页 |
1.1.1 转录 | 第9-11页 |
1.1.2 翻译 | 第11-12页 |
1.2 载体 | 第12-14页 |
1.2.1 自主复制质粒载体 | 第12-13页 |
1.2.2 整合质粒 | 第13页 |
1.2.3 噬菌体 | 第13-14页 |
1.3 外源蛋白的分泌表达 | 第14-15页 |
1.3.1 信号肽和信号肽酶 | 第14-15页 |
1.3.2 蛋白质的分泌表达 | 第15页 |
1.4 巨大芽孢杆菌——高效分泌外源蛋白的宿主 | 第15-16页 |
1.5 存在问题和发展方向 | 第16页 |
2 本研究的目的及意义 | 第16-17页 |
3 材料与方法 | 第17-30页 |
3.1 材料与试剂 | 第17-19页 |
3.1.1 菌株及载体 | 第17-18页 |
3.1.2 分子生物学试剂 | 第18页 |
3.1.3 主要药品 | 第18页 |
3.1.4 培养基 | 第18-19页 |
3.1.5 抗生素及溶菌酶贮存液 | 第19页 |
3.2 主要仪器 | 第19页 |
3.3 常用缓冲液及其配制 | 第19-22页 |
3.4 试验方法 | 第22-30页 |
3.4.1 引物的设计 | 第22页 |
3.4.2 目的DNA片段的获得 | 第22-23页 |
3.4.3 目的DNA片段的克隆 | 第23-24页 |
3.4.4 表达载体的扩增 | 第24-25页 |
3.4.5 重组表达载体的构建 | 第25-26页 |
3.4.6 重组表达质粒在巨大芽孢杆菌中的转化及表达 | 第26-27页 |
3.4.7 纤维素酶活力测定 | 第27-28页 |
3.4.8 表达产物SDS-PAGE分析 | 第28-29页 |
3.4.9 内切葡聚糖酶基因工程菌培养条件的初步研究 | 第29-30页 |
3.4.10 基因工程菌pHBM-End酶学性质研究 | 第30页 |
4 结果分析 | 第30-42页 |
4.1 引物的设计 | 第30-31页 |
4.2 目的DNA片段的获得 | 第31页 |
4.3 目的DNA片段的克隆 | 第31-32页 |
4.4 表达载体的扩增 | 第32页 |
4.5 重组表达载体的构建 | 第32-34页 |
4.6 重组表达质粒在巨大芽孢杆菌中的转化及表达 | 第34-36页 |
4.7 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第36页 |
4.8 内切葡聚糖酶基因工程菌培养条件的初步研究 | 第36-40页 |
4.9 基因工程菌pHBM-End酶学性质研究 | 第40-42页 |
5 讨论 | 第42-46页 |
5.1 信号肽对外源基因表达的影响 | 第43页 |
5.2 培养条件对外源基因表达的影响 | 第43-44页 |
5.3 外源基因及宿主菌对基因表达的影响 | 第44-45页 |
5.4 工程菌pHBM-End的酶学性质 | 第45-46页 |
结论 | 第46-47页 |
参考文献 | 第47-51页 |
致谢 | 第51-52页 |
攻读硕士学位期间参与发表的文章 | 第52页 |
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