苦马豆素诱导A549细胞和Eca-109细胞凋亡的信号转导通路研究

苦马豆素（1，2，8-trihyroxyindolizidine，swainsonine，SW）是从豆科黄芪属（Astrgalus）和棘豆属（Oxytropis）植物中分离得到的一种吲哚兹定生物碱，能够在体内外抑制多种肿瘤细胞的生长，但其作用机制尚不清楚。许多化疗药物抑制肿瘤细胞生长是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的，因此，研究肿瘤细胞凋亡信号转导通路，探索药物的抑瘤机制，已成为现代生物学研究的热点。本论文以人肺癌A549细胞和食管癌Eca-109细胞为研究对象，对SW在体外诱导细胞凋亡的情况和诱导凋亡的信号转导通路进行了研究，并复制了A549细胞Eca-109细胞裸鼠移植瘤模型，研究了SW在体内抑制肿瘤生长作用及机制。研究得到如下结果：1. MTT检测结果显示，SW能够在体外剂量依赖性抑制人肺癌细胞系A549，Calu-3，H1299，SPC-A-1细胞和食管癌细胞系Eca-109，TE-1，TE-10细胞生长，且对肺癌细胞的生长抑制作用比对食管癌更强。表明SW对不同组织来源的肿瘤细胞的敏感性存在一定差异。2.以A549细胞和Eca-109细胞为模型，对SW体外诱导细胞凋亡进行了研究。琼脂糖凝胶电泳显示，12μM的SW处理A549细胞24h或58μM的SW处理Eca-109细胞48h，基因组DNA被切断成180~200bp整数倍大小的片段；DAPI和AO/EB荧光染色显示，SW处理的细胞发生染色质凝聚、核固缩等凋亡特征性现象；电子显微镜观察到SW处理的细胞发生皱缩变圆、体积变小、表面微绒毛消失、核固缩、细胞内出现空泡、细胞膜内陷包裹细胞内容物形成凋亡小体的现象；Annexin V-FITC/PI双荧光染色流式细胞术检测显示，随着SW处理剂量的增加或处理时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高，呈现出一定的剂量和时间依赖性关系，表明SW是通过诱导细胞凋亡抑制A549细胞和Eca-109细胞生长。3.以12μM的SW处理A549细胞0~24h或58μM的SW处理Eca-109细胞0~48h，Caspase活性检测试验和Western blot检测结果均显示，SW处理能够时间依赖性激活Caspase-9和Caspase-3，而对Caspase-8的活性没有显著影响；广谱Caspase抑制剂，Caspase-9和Caspase-3的特异性抑制剂均能够抑制SW的凋亡诱导作用，显著降低细胞凋亡率，表明SW诱导的细胞凋亡依赖于Caspase-9/-3级联活化。SW处理对Fas，FasL的表达量没有明显影响，表明SW诱导的细胞凋亡不激活Fas/FasL/Caspase-8通路。Real-time qPCR和Western blot检测结果显示，SW处理能够上调促凋亡的Bax，下调抑制凋亡的Bcl-2，增加Bax/Bcl-2的比率，促进Bax从细胞浆向线粒体转位。JC-1染色、流式细胞术检测显示，随着Bax从细胞浆向线粒体转位，线粒体膜电位（mitochondrialmembrane potential，Δψm）去极化的细胞比率逐渐增加，提示SW是通过调节Bax和Bcl-2的表达影响线粒体的功能。进一步研究显示，线粒体中促凋亡分子细胞色素（ccytochromec，Cyt c）在SW作用下从线粒体释放到细胞浆中，在细胞浆中与凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease activating factor1，Apaf-1）和Caspase-9酶原结合为凋亡体（apoptosome），进而活化Caspase-9/-3级联反应，Caspase-3作为SW诱导细胞凋亡的主要执行分子对细胞内成分如多聚ADP核糖聚合酶（polyADP ribose polymerase，PARP等进行广泛降解，最终导致细胞凋亡。本研究未检测到线粒体第二激活因子（mitochondrial second mitochondrial-derived activator of caspase，Smac）和凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）伴随Cyt c释放出线粒体。SW处理具有野生型p53的A549细胞能够显著上调p53mRNA水平，明显增加p53蛋白含量，并在一定程度上促进p53蛋白磷酸化。但是，SW似乎并不能显著影响p53的转录活性。p53抑制剂pifithrin-α不能显著降低SW诱导的细胞凋亡率，表明在SW诱导的细胞凋亡过程中，p53可能不是以激活或抑制某些凋亡相关基因表达的方式发挥调控作用。4.胸腺缺陷型BALB/c nu/nu裸小鼠接种A549细胞或Eca-109细胞，复制荷瘤小鼠模型，以剂量为1mg/kg/d和2.5mg/kg/d的SW灌胃治疗。在灌胃15d时开始观察到SW对A549细胞移植性肿瘤块生长的显著抑制作用，25d开始观察到对Eca-109细胞移植性肿瘤块生长的显著抑制作用。分别在灌胃15d和35d处死A549细胞荷瘤小鼠和Eca-109细胞荷瘤小鼠，取出肿瘤组织进行检测。结果发现，与对照组相比，灌胃SW能够显著降低移植性肿瘤块的湿重，表明SW能够抑制A549和Eca-109移植性肿瘤块在小鼠体内的生长速度。肿瘤组织学检测显示，SW治疗组移植性肿瘤组织变得较为疏松，部分肿瘤细胞核碎裂，组织间有一定量的巨噬细胞和中性粒细胞浸润，与对照组肿瘤组织细胞旺盛生长的状态有明显的差异。TUNEL染色检查发现，SW治疗组肿瘤组织均出现TUNEL阳性染色的凋亡细胞，且凋亡细胞数目随SW灌胃剂量加大而增多，表明SW也能在体内诱导肿瘤细胞凋亡。免疫组织化学染色和Western blot检测结果均显示，灌胃SW可上调移植性肿瘤中Bax、下调Bcl-2的表达，同时促进Bax和Cyt c在移植性肿瘤细胞胞浆与线粒体之间的互相转位，表明线粒体通路在SW体内诱导细胞凋亡过程中被激活，提示SW在体内和体外诱导细胞肿瘤凋亡的机制一致。对SW灌胃的荷瘤小鼠主要脏器进行病理学观察的结果表明，SW对小鼠小脑、心、肺、脾等不产生明显的组织病理学变化，但高剂量SW能够引起肝和肾发生轻微组织病理学变化。本论文首次阐明SW是通过激活细胞线粒体信号转导通路诱导A549细胞和Eca-109细胞发生凋亡，从而抑制其在体内外生长。研究结果将为进一步揭示SW的抑瘤机理和研发SW成为肿瘤治疗药物奠定基础。