颅脑损伤在法医暴力性死亡案例中占首要位置,而脑外伤(traumatic brain injury, TBI)是颅脑损伤中最重要的损伤。在现代社会里,脑外伤发生和死亡率在青年人群中较高,也是在日常生活中入院治疗的主要原因之一。脑损害的相关研究一直是临床医学与神经生物学的重要研究内容,同时也是法医学研究工作的重要内容之一。过去的法医病理学领域专注于脑损伤的不良后果及与外力的作用机制相关性研究。因此,研究脑外伤后细胞损伤发生的机制,对医学和法医学均具有重要意义。脑外伤引起的神经元机械性损害能引起一系列的反应,如线粒体与溶酶体膜完整性损害、脑水肿、神经细胞死亡,以至影响脑的运动与学习记忆功能。脑外伤后细胞死亡机制已被深入研究。最近,有少量的文献报道脑外伤后细胞自噬活性增强。自噬是一个过程,即：亚细胞膜结构发生动态的形态学改变,并通过溶酶体介导蛋白质和细胞器降解的过程,主要包括4个环节：底物诱导自噬前体(proautophagosome, PAS)的形成、自噬体(autophagosome)形成、自噬体与溶酶体融合和自噬体内容物被降解。一个突破性的研究表明凋亡抑制分子Bcl-2可以通过与自噬的标记物之一Beclin-1相互作用,进而对自噬发挥作用。自噬激活过程,往往与凋亡共存或同时发生。有研究发现在脑外伤后24h神经元中微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)的表达明显增强。然而,却未见有文献报道自噬在脑外伤引起的细胞死亡和创伤性脑损害中的作用。基于以前的研究,我们提出了自噬机制参与了脑外伤引起脑损害的假设。为了证实这个假设,本课题的第一部分采用了自噬的特异性抑制剂,在小鼠体内脑外伤模型中,研究了自噬在脑外伤引起的细胞死亡及脑损害中发挥的作用及机制,并探讨了自噬与凋亡的相互关系。在此基础上,在第二部分我们研究了脑外伤后自噬激活的调节机制及凋亡信号通路之间的关系。有研究报道p53与它的靶基因(PUMA、损害相关自噬调节因子DRAM)参与了自噬与凋亡过程。在体外兴奋性中毒模型中,谷氨酸受体的过度刺激能诱发核因子-kappaB (NF-κB)依赖性的p53表达。并且NF-K B/p53途径通过凋亡与自噬的机制,参与了神经毒性神经元死亡。然而,很少有研究报道NF-K B/p53在小鼠脑外伤模型中的作用。在此,我们研究了NF-K B/p53途径在脑外伤后自噬与凋亡激活中发挥的可能作用。细胞质膜完整性的丧失包括膜的起泡和通透性的改变,被认为是引起脑外伤后继发性神经元损伤的主要因素,可以引起离子平衡失调与多种细胞途径的激活。泊洛沙姆188(Poloxamer188, P188)是一种非离子型、无毒的两性分子聚合物(分子量约为8400),包括中心疏水分子与两侧围绕的两条聚氧乙烯亲水链。P188作为一种表面活性剂有多种临床运用价值,它被发现能修复受损的细胞膜。在小鼠皮质损伤模型中,P188这种公认的膜修复剂也显现出对细胞膜有很好的修复效果。而在皮质与海马神经元培养中,P188具有保护神经元免受兴奋性中毒或氧化应激相关的坏死,并通过进入膜内参与抑制膜的过氧化反应起到免受电穿孔的作用。然而,P188对脑外伤的神经保护机制尚不十分清楚,本研究中我们通过建立原代神经元损伤模型,在TBI后继发性损害(如线粒体与溶酶体膜通透性改变)方面探讨其神经保护作用机制。第一部分自噬对脑外伤引起的质膜完整性破坏、脑缺损体积和神经功能的影响背景之前的研究表明脑外伤后自噬被激活,并增加LC3在神经元中的表达。然而,自噬在脑外伤的作用机制还不是很明了。本部分研究的主要目的是探讨自噬在脑外伤后神经细胞死亡中的作用和对神经功能的影响。方法我们使用改良的自由落体法建立小鼠脑外伤模型。在建模前10min,通过单侧侧脑室分别注射自噬的特异性抑制3-甲基腺嘌呤(3-MA)与布雷菲德菌素(BFA)。我们首先使用透射电镜进行观察,测定了脑外伤后自噬活性的改变情况。接着我们采用real-time PCR检测LC3的mRNA水平,并通过免疫印迹法检测LC3Ⅱ与p62蛋白表达水平,它们均能用来评估自噬的表达水平。通过荧光双标LC3与碘化丙啶(PI),观测LC3在受损细胞中的表达情况。PI标记用来鉴别受损的细胞,并计数PI阳性细胞的数目。为了进一步探讨PI阳性细胞能否代表细胞的永久性丢失,我们在脑外伤后第七天还检测了损伤后脑组织累积缺损的体积。最后,为进一步研究3-MA抑制自噬是否与神经功能改善有关,我们还做了行为学试验,包括运动功能检测和水迷宫实验。结果①电镜检测结果：与假手术组相比,脑外伤后1h至24h,神经元超微结构主要变化为自噬体(APs)与自噬溶酶体(ALs)的数量明显增多。并在脑外伤后48h,可以看到细胞核内染色质有明显的核裂解现象发生。②LC3的表达水平检测结果：从脑外伤后1h至48h,LC3mRNA与蛋白水平均明显上调,而在脑外伤后6h与24h,3-MA预防性给药后能明显下调受损皮质中LC3mRNA与LC3-Ⅱ蛋白水平。③p62的蛋白表达结果：与假手术组相比,脑外伤后6h与24h,p62在损伤侧的蛋白表达明显减少。而与脑外伤Saline组相比,3-MA与BFA预防性给药后均能维持p62的蛋白表达水平。④LC3免疫荧光检测结果：在脑外伤后24h,LC3的免疫荧光反应性增强,LC3的染色模式发生改变,即具有点状的染色模式增多,而且LC3阳性细胞与损伤中心的PI阳性细胞共表达数量增多。增加的点状LC3-Ⅱ与PI核染的细胞数被3-MA局部抑制。⑤PI细胞计数结果：与假手术组相比,PI阳性细胞数量在脑外伤后12h至72h显著性增加,并在48h时间点达到高峰。分别与脑外伤后24h与48h的生理盐水组相比,3-MA与BFA预防性给药均能明显较少PI阳性细胞数。⑥脑缺损体积检测：脑外伤也能引起脑组织的永久性丢失。与脑外伤生理盐水组相比,3-MA与BFA给药后均能明显减轻脑外伤引起的体积缺损。⑦运动功能实验检测结果：在脑外伤后1-4天,脑外伤引起小鼠的运动评分明显降低(P<0.01),在第5天恢复到本底水平。在脑外伤后1-3天,3-MA给药后能明显加快运动功能的恢复(P<0.05)。⑧水迷宫实验结果：等各组之间的运动功能无明显差异时,可继续在11-20天进行水迷宫实验。与11-18天的假手术组相比,脑外伤后小鼠找到隐蔽平台的潜伏期均延长(P<0.05)。与脑外伤Vehicle组相比,外伤后14-17天3-MA给药组的小鼠寻找潜伏期的时间明显缩短(P<0.05)。为了排除视力的影响,在实验的19与20天暴露出平台,所有小鼠寻找平台的潜伏期均明显缩短,但差别不大(P>0.05)。最后,与假手术组相比,脑外伤3-MA处理的大鼠每天学习的程度更接近假手术小鼠,而脑外伤Vehicle组的小鼠每天学习的程度却明显下降(P<0.05)。3-MA抑制自噬能减轻行为学功能障碍,包括运动功能和记忆功能。结论脑外伤后脑皮质区细胞自噬活性增强、凋亡被激活。脑外伤引起的自噬激活可被自噬的抑制剂3-MA与BFA所抑制,表明细胞自噬参与了脑损害过程。增加的点状LC3-Ⅱ与PI核染的细胞数被3-MA局部抑制,表明自噬与细胞死亡可能存在某种关联,自噬可能参与了脑外伤引起的神经元死亡。此外,3-MA与BFA均能减轻脑外伤引起的细胞死亡与体积缺损。自噬抑制剂的这些保护作用可能与抑制脑外伤引起LC3表达上调,与p62蛋白表达的下调有关。总之,以上数据表明,自噬途径参与了脑外伤后病理生理学反应,抑制自噬途径也许能帮助减轻创伤性外伤性脑损害和功能障碍。第二部分脑外伤后自噬激活的调节机制及与凋亡信号通路之间关系的研究背景第一部分的研究结果显示自噬参与了脑外伤后的病理生理变化过程。之前有文献报道p53与它的靶基因(PUMA、损害相关自噬调节因子DRAM)参与了自噬与凋亡过程。在体外兴奋性中毒模型中,谷氨酸受体的过度刺激能诱发核因子-kappa B(NF-κB)依赖性的p53表达。并且NF-κB/p53途径通过凋亡与自噬的机制,参与了神经毒性神经元死亡。然而,很少有研究报道NF-κB/p53在小鼠脑外伤模型中的作用。本部分的主要研究目的是探讨NF-κB/p53途径在脑外伤后自噬与凋亡激活中发挥的可能作用。方法我们使用改良的自由落体法建立小鼠脑外伤模型。在建模前10min,通过单侧侧脑室分别注射自噬的抑制剂3-MA、NF-κB抑制剂SN50、与p53抑制剂Pifithrin-alpha (PFT-α)。采用实时PCR与免疫印迹法,检测了脑外伤后p53和它的靶基因PUMA、DRAM的时程改变,以及3-MA对它们的影响。同时为了观察NF-κ B依赖性的p53-DRAM信号通路是否参与了TBI诱导的神经元自噬与凋亡,我们还研究了SN50与PFT-α对脑外伤后p53和DRAM的作用。此外,SN50与PFT-α在脑外伤中的神经保护作用可通过检测DNA条带断裂和缺损体积情况来完成。结果从脑外伤后1h至24h,外伤能引起p53, PUMA和DRAM表达的明显上调,并具有一定的时程变化规律。在脑外伤后6h与24h,3-MA均能明显逆转上述蛋白的上调(P<0.05)。在脑外伤后24h,SN50与PFT-α均能逆转p53、PUMA表达的上调。脑外伤可引起DNA片段的断裂,并导致脑组织的永久性丢失(P<0.05),但与生理盐水组相比,SN50和PFT-α均能明显减少脑外伤引起的DNA片段断裂与体积的缺损(P<0.05)。结论以上结果表明脑外伤可引起NF-κB依赖性的p53的表达,NF-κB/p53途径可通过自噬和凋亡机制参与脑外伤引起的细胞丢失与体积缺损。第三部分质膜修复对脑外伤后自噬/溶酶体途径和细胞凋亡的调节机制研究背景脑外伤引起的急性膜损害是关键的上游信号通路,可能参与了脑外伤后自噬激活和神经细胞凋亡等继发性神经损害过程,如线粒体与溶酶体膜的完整性破坏等。本部分将研究一种非离子型表面活性剂P188对线粒体与溶酶体膜是否具有修复作用,探讨质膜修复的神经保护作用是否通过调节自噬/溶酶体途径和细胞凋亡通路完成的这一新机制。方法本研究采用体外神经元离心法,可引起原代培养的神经元膜完整性遭到破坏。在损伤后10min,神经元分别与P188或一种cathepsin B抑制剂共培养。为了研究P188对原代神经元的保护作用及可能的机制,我们首先采用了光学显微镜观察,以及MTT和LDH检测。线粒体膜电位△ψm检测可通过JC-1染色来完成,同时检测了提纯的线粒体Cyt-c与切割型Bid (tBid)的蛋白水平。此外,溶酶体膜完整性检测也可采用检测提纯的溶酶体中cathepsin B与tBid的蛋白表达水平。结果脑外伤后P188治疗性给药可增加细胞的存活率,减轻线粒体膜电位的破坏,能抑制损伤引起的Cyt-c从线粒体中释放,以及cathepsin B从溶酶体中释放。采用cathepsin B的抑制剂CBI也能增加神经元的存活率,维持线粒体膜稳定性,并抑制脑外伤引起的Cyt-c的释放。P188与CBI治疗均能减少溶酶体上层亚组分,以及线粒体亚组分中tBid的表达水平。结论以上数据表明受损的神经元遭受了线粒体与溶酶体膜损害,这些机制可通过药物干预的方法来探讨。P188的神经保护作用可能与cathepsin B与tBid介导的线粒体凋亡启动二者之间的联系有关,即质膜修复剂可通过修复受损的线粒体和溶酶体以调节自噬/溶酶体途径和细胞凋亡通路起到神经保护作用。
