[实验目的]探讨抑制PI3K活性后XWLC-05(云南宣威肺腺癌)细胞和A549细胞的放射增敏效应、PI3K/AKT通路相关蛋白的表达变化情况及DNA损伤与修复的差异。[实验方法]一是采用Western-Blotting检测LY294002抑制PI3K活性前后PI3K/AKT通路相关蛋白(AKT蛋白、p-AKT308和p-AKT473蛋白)和DNA损伤修复相关蛋白(DNA-PKcs蛋白、Ku70和Ku80蛋白)的表达情况；二是经克隆形成实验,比较研究阻断PI3K/AKT通路后A549细胞和XWLC-05细胞的放射杀灭效应；三是通过彗星实验检测阻断PI3K/AKT通路前后DNA双链断裂情况、DNA修复时间效应差异,探讨可能存在的作用机制。[实验结果]1. PI3K/AKT相关蛋白表达：XWLC-05对照组细胞的蛋白(p-AKT473和p-AKT308)表达均高于A549对照组细胞(p<0.01),说明XWLC-05细胞PI3K活性较A549细胞高。加入LY294002后,AKT蛋白表达各组无明显改变(p>0.05)。两者的Ser473蛋白随着药物浓度增大,抑制作用增强(p<0.01)。联合照射时抑制作用更强,A549细胞和XWLC-05细胞均在8Gy(p<0.01)达到最佳抑制；两种细胞对照组与8Gy比较发现：XWLC-05细胞灰度值差值均比A549细胞要大,说明在联合放射情况下,LY294002对XWLC-05细胞的抑制程度较A549细胞高。2.克隆形成实验显示：无论是XWLC-05细胞还是A549细胞在加入LY294002后存活分数下降,放射敏感性提高。另外实验显示：XWLC-05对照组细胞的存活分数比A549细胞加药组的还要低,提示XWLC-05细胞较A549细胞具有更高的放射敏感性,两种细胞存在放射敏感性差异。3.DNA损伤修复相关蛋白表达：A549与XWLC-05比较两种细胞加入LY294002前后Ku70、Ku80蛋白的表达无明显变化(p>0.05),不受加药浓度和时间的影响而变化。单纯加药对于A549细胞和XWLC-05细胞DNA-PKcs的表达均无明显抑制(p>0.05),而当加药同时照射时,加药24h抑制再照射1h后出现明显的DNA-PKcs表达降低(p<0.01),XWLC-05细胞较A549细胞趋势更为明显,但是无统计学差异。照射24小时后表达又恢复至正常水平。说明LY294002与放射联合能够抑制DNA-PKcs的表达,且随着时间的延长抑制作用降低。4.彗星实验显示：DNA损伤曲线：A549细胞和和XWLC-05细胞均表现出DNA损伤呈剂量依赖性增加,两对照组出无明显差异(p>0.05)；加入LY294002抑制以后DNA损伤较对照组增强(p<0.01),与A549细胞相比,XWLC-05细胞表现出损伤更严重。DNA修复曲线：A549细胞和和XWLC-05细胞均表现出DNA损伤呈时间依赖性降低,加入LY294002组DNA损伤较对照组严重,且随着修复的进行,DNA损伤仍然比对照组严重。[结论]1. XWLC-05细胞PI3K活性比A549细胞高,LY294002对XWLC-05细胞PI3K的活性的抑制程度较A549细胞强。2.抑制PI3K/AKT活性增加了XWLC-05和A549细胞的放射敏感性,XWLC-05细胞的固有放射敏感性较A549细胞强。3.抑制PI3K/AKT活性对Ku70、Ku80蛋白表达的抑制不明显,联合照射后1h能够抑制DNA-PKcs的表达,对XWLC-05细胞抑制更明显,随着时间的延长,抑制作用减弱。4.抑制PI3K/AKT活性增加了XWLC-05和A549细胞的DNA损伤,降低了DNA修复的能力,并延迟了修复时间。
