研究背景胃癌是常见消化道恶性肿瘤之一,我国胃癌患者死亡率较高。胃癌的侵袭转移是治疗失败及复发的重要原因,临床尚缺乏有效的干预措施。近来研究发现,肿瘤的侵袭转移与空泡型质子泵(the vacuolar H+-adenosine triphosphatase, V-ATPases)密切相关。在肿瘤组织中V-ATPases高表达,并能够感知细胞内pH,以ATP为能量,将癌细胞产生的过多的H+泵出细胞外,导致胞外的酸性微环境。国内上海交通大学肿瘤研究所通过RNA干扰技术抑制V-ATPases的基因表达,有效抑制了肿瘤的侵袭转移。但V-ATPases在利用质子泵功能维持细胞内外特定的pH值同时,又作用于哪些信号通路影响肿瘤细胞的侵袭转移能力,尚未明确。本研究拟通过沉默胃癌细胞SGC7901中V-ATPases表达,研究V-ATPases与Wnt/β-catenin信号通路之间的关系。近年来,已经发现一些药物及分子能抑制V-ATPases,如巴弗洛霉素、NIK12192及FR202126等,但尚无相关药物进入临床。山荷叶素是传统中药山荷叶提取物的主要成分,属于木脂素类化合物,具有较好的抗肿瘤活性,而对正常细胞毒性很小。但山荷叶素抗肿瘤的确切机制尚未完全清楚。近来有研究表明,山荷叶素能抑制破骨细胞的V-ATPases的活性,且抑制活性与山荷叶素有剂量依赖关系。那么山荷叶素对胃癌细胞V-ATPases是否同样具有抑制作用,且效应如何?国内外尚无相关报道。基于上述研究前提,本项目选择了山荷叶素作为胃癌细胞V-ATPases抑制剂,研究其阻断Wnt/β-catenin信号通路的作用及与胃癌细胞增殖侵袭的关系。本实验分为三个部分：第一部分研究V-ATPases蛋白表达和胃癌临床病理特征和预后的相关性；第二部分研究沉默V-ATPases基因对胃癌细胞SGC7901增殖和侵袭能力的影响及机制：第三部分为山荷叶素调控V-ATPases对胃癌细胞增殖侵袭影响的体内外研究。第一部分V-ATPases蛋白表达和胃癌临床病理特征及预后的相关性研究目的：研究V-ATPases蛋白在胃癌组织中的表达及与临床病理特征和预后的相关性。方法：运用免疫组化技术检测50例胃癌组织、正常组织的V-ATPases蛋白农达水平,,并统计分析V-ATPases表达与临床病理指标和预后的关系。结果：胃癌组织中V-ATPases蛋白阳性表达率为76%,高于正常组织(30%)。胃癌组织中V-ATPases表达与肿瘤大小(P=0.017)、病理分级(P=0.038)、淋巴结转移(P=0.029)有相关性,与其它临床病理特征性别、年龄、浸润深度、脉管浸润及TNM分期无明显相关性；在运用Cox回归单因素模型进行单变量分析中，肿瘤大小、脉管浸润、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期和V-ATPases是重要的预后影响因素,P值分别为0.000、0.009、0.003、0.000、0.000、0.000。采用Cox比例多因素模型进行多变量分析结果显示,V-ATPases表达和TNM分期可能是预后的独立影响因素,P值分别为0.010和0.001。结论：V-ATPases在胃癌组织中的蛋白表达水平明显高于正常组织,V-ATPases可能与胃癌发生、进展相关。V-ATPases蛋白表达与肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移有关,可能是影响胃癌预后的一个重要指标。第二部分沉默V-ATPases基因对胃癌细胞SGC7901增殖和侵袭能力的影响及机制目的：利用转染小干扰RNA沉默人胃癌细胞株SGC7901的V-ATPases,分析V-ATPases在对胃癌细胞增殖、转移的作用及机制。方法：对于未转染的细胞株、转染siRNA-GAPDH、转染siRNA-V-ATPases的SGC7901细胞株,采用MTT试剂盒测定其细胞的生存率,以及克隆形成试验计算增殖率；运用AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡；采用Transwell进行细胞侵袭试验,以确定V-ATPases在胃癌细胞侵袭中的作用；并测定干扰前后SGC7901细胞株中Wnt/β-catenin信号通路中LRP磷酸化及对其下游基因的表达。结果：SGC7901细胞株经转染siRNA-V-ATPases后,细胞的增殖、克隆形成能力显著降低,凋亡率显著上升,并表现出剂量依赖关系。Transwell实验结果提示,转染siRNA-V-ATPase后SGC7901细胞迁移能力下降。以上结果提示,V-ATPases在胃癌的增殖、侵袭中具有一定作用。进一步研究结果显示,干扰SGC7901细胞株V-ATPases表达后,LRP磷酸化受到抑制,Wnt/β-catenin信号通路中下游基因β-catenin、Cyclin-D1及C-Myc表达显著下降(P<0.05)。结论：V-ATPases在胃癌细胞株SGC7901增殖、侵袭中具有一定作用,靶向抑制V-ATPases后,胃癌细胞株SGC7901增殖、侵袭能力下降,同时能抑制Wnt/β-catenin信号通路中LRP磷酸化。V-ATPases有望成为治疗胃癌新的靶点。第三部分山荷叶素调控V-ATPases对胃癌细胞增殖侵袭影响的体内外研究目的：研究山荷叶素(diphyllin)对胃癌细胞SGC7901增殖和侵袭的影响,并探讨与V-ATPases表达、Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法：将不同浓度的diphyllin作用于SGC7901细胞株不同时间,采用MTT试剂盒测定其细胞的生存率,以及克隆形成试验计算增殖率。采用Tran swell进行细胞侵袭试验,以确定山荷叶素在胃癌细胞侵袭中的作用；并测定山荷叶素作用前后SGC7901细胞株中Wnt/β-catenin信号通路中LRP磷酸化及其下游基因表达的差异。建立裸鼠皮下荷瘤模型,分析diphyllin在裸鼠体内对胃癌生长的影响。结果：不同浓度的diphyllin作用于SGC7901细胞后,细胞的增殖、克隆形成能力显著降低,凋亡率显著上升,并表现出剂量依赖关系,48小时IC50为7.8μM。5μM、10μM浓度山荷叶素作用后SGC7901细胞迁移能力下降。同时,diphyllin能抑制胃癌细胞中V-APTase基因及蛋白表达,并降低细胞内pH,逆转细胞内外pH梯度。进一步研究发现,山荷叶素能抑制磷酸化LRP表达,并下调其下游基因β-catenin、Cyclin-D1及C-Myc表达(P<0.05)。动物实验结果显示,裸鼠在给予diphyllin后,移植瘤体积显著减小,净体重较对照组升高,瘤体中V-APTases表达下降,外周血清中MMP-2、MMP-9表达显著下降(P<0.05)结论：diphyllin在体内外均可抑制胃癌细胞SGC7901的增殖、侵袭能力,并诱导凋亡,其机制可能与抑制V-APTases表达、抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。
