CILP2诱导THP1源性泡沫细胞形成

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第一部分人CILP2基因真核表达载体的构建和鉴定目的:构建人pIRES2-EGFP-CILP2-Flag质粒方法:提取HEK293细胞mRNA,逆转录成模板DNA,高保真酶PCR获取CILP2-Flag基因片段,经BglII和EcoRI双酶切,连接重组至pIRES2-EGFP空载质粒上。双酶切和基因测序鉴定质粒构建效果。结果:BglII和EcoRI双酶切重组质粒,经琼脂糖凝胶电泳,在约3.5kb和5.3kb处出现条带,初步鉴定重组质粒构建成功。测序结果经NCBI blast对比分析,核酸序列与GenBank中CILP2CDS区序列同源性完全一致,且C端正确带上Flag片段。结论:成功构建pIRES2-EGFP-CILP2-Flag标签质粒,为后续实验奠定了良好的实验基础。第二部分cilp2基因在小鼠体内表达分布和不同病理模型中的表达差异目的:检测cilp2基因在正常C57BL/6J小鼠体内的mRNA表达分布,以及在ApoE-/-小鼠和冠心病人中的mRNA和蛋白表达差异。方法:取普食喂养C57BL/6J12周龄雄性小鼠3只脱颈处死,留取心,肝,脾,胃,肌肉,脑,肾,肺组织,提取mRNA,逆转录成cDNA, RT-PCR测定cilp2表达分布;取C57BL/6J和ApoE-/-12周龄雄性小鼠,取主动脉和冠状动脉组织,提取mRNA和蛋白,分别用RT-PCR和western blot方法检测cilp2表达;取冠心病人和正常人骨骼肌组织,提取mRNA和蛋白, RT-PCR和western blot方法检测CILP2表达差异;重复实验3次。结果:cilp2在小鼠肌肉中表达较高,其后依次是心脏、大脑、肾脏、肺、胃、脾、肝脏和小肠;ApoE-/-小鼠肌肉、主动脉和冠状动脉组织cilp2含量较C57BL/6J小鼠明显增高;冠心病人骨骼肌中CILP2表达较正常人明显增高。结论:cilp2在动脉粥样硬化疾病模型中表达显著升高,可能在动脉粥样硬化形成过程中产生影响。第三部分CILP2分泌蛋白的验证目的:验证CILP2为分泌蛋白。方法:分别用pIRES2-CILP2-Flag质粒和pIRES2-EGFP空载质粒转染HEK293T细胞48h,提取胞内蛋白和上清培养液。用anti-Flag M2亲和磁珠免疫沉淀蛋白,western blot检测目的蛋白。各取三人300ul血浆,PBS稀释30倍,10%SDS-PAGE凝胶做western blot检测人血浆中CILP2含量,以及正常人和冠心病人血浆中CILP2表达差异。结果:转染CILP2-Flag质粒的细胞上清中含有CILP2蛋白;人血浆中含有CILP2蛋白;冠心病人血浆中CILP2蛋白含量显著高于正常人。结论:CILP2是一种分泌蛋白,在冠心病人血浆中含量高于正常人。第四部分CILP2对THP1源性泡沫细胞形成的作用目的:探讨CILP2对泡沫细胞形成的影响和可能机制。方法:oxLDL作用于THP1巨噬细胞,RT-PCR检测细胞内CILP2mRNA随oxLDL作用时间和剂量的变化;将CILP2腺病毒感染THP1巨噬细胞48h,RT-PCR方法检测清道夫受体(SR-AI,CD36,CD68,LOX-1),TF,PAI-1mRNA的表达变化;在oxLDL存在下,感染CILP2腺病毒,油红O检测THP1巨噬细胞甘油三酯聚集情况。结果:THP1巨噬细胞内CILP2mRNA表达随oxLDL作用剂量和时间增加而增加,分别在20ug/ml和24h表达量达到最高;感染CILP2腺病毒48h后,细胞内CILP2mRNA和蛋白水平显著升高(p <0.05),清道夫受体SR-AI,CD68mRNA较对照组有显著升高(p <0.05);CD36、LOX-1、TF和PAI-1mRNA改变没有显著差异;油红O染色显示,在oxLDL存在下,感染CILP2腺病毒细胞内脂质聚集明显增高(p<0.05)。结论:CILP2通过增加清道夫受体SR-AI和CD68表达,有助于THP1巨噬细胞对脂质摄取,形成泡沫细胞。
英汉缩略语名词对照第5-7页
摘要第7-11页
ABSTRACT第11-15页
前言第16-18页
第一部分 人 CILP2 基因真核表达载体的构建及鉴定第18-32页
    1 材料与方法第18-27页
    2 结果第27-30页
    3 讨论第30-32页
第二部分 cilp2 基因在小鼠体内表达分布和不同病理模型中的表达差异第32-39页
    1 材料与方法第32-35页
    2 结果第35-37页
    3 讨论第37-39页
第三部分 CILP2 分泌蛋白的验证第39-49页
    1 材料与方法第39-45页
    2 结果第45-47页
    3 讨论第47-49页
第四部分 CILP2 对 THP1 源性泡沫细胞形成的作用第49-59页
    1 材料与方法第49-53页
    2 结果第53-56页
    3 讨论第56-59页
全文总结第59-60页
参考文献第60-64页
文献综述第64-74页
    参考文献第69-74页
致谢第74-75页
攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文第75-76页
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