目的：血友病A是由于遗传性凝血因子Ⅷ基因缺陷,造成血浆凝血因子Ⅷ含量不足或功能缺陷,引起的一组终身出血的凝血障碍性疾病。凝血因子Ⅷ是治疗血友病的唯一有效用药,它的生产原料就是血浆,而血浆的严重不足造成了目前凝血因子Ⅷ一药难求的局面,也使有些患者不治而亡。血友病A的治疗主要包括血浆来源的凝血因子Ⅷ(plasma-derived FⅧ, pdFⅧ)和重组凝血因子Ⅷ (recombinant FⅧ, rFⅧ)制剂。重组凝血因子Ⅷ制剂的问世是血友病治疗史上的一大突破,由于生产工艺繁琐、价格昂贵其生产仅限于发达国家。目前国内对血友病A的治疗仍以血浆凝血因子Ⅷ浓缩剂为主,然而接受这类血液制品的患者其感染病毒性肝炎及艾滋病等传染性疾病的风险较高。重组凝血因子Ⅷ在生化、免疫、凝血活性及药物动力学等方面与血浆来源的凝血因子Ⅷ无明显差别,但其在纯度、抗原性、安全性、无自身血源性病毒感染等方面具有血浆来源的凝血因子Ⅷ无法比拟的优点,具有良好的应用前景。面对目前国内凝血因子Ⅷ的短缺,利用基因工程生产重组凝血因子Ⅷ成为解决其短缺的一个重要方法。B区缺失型(△760aa-1639aa)人凝血因子Ⅷ (B domain-deleted human FⅧ, BDDhFⅧ)与野生型凝血因子Ⅷ具有相同的生物学特性,但B区缺失型凝血因子Ⅷ却解决了载体包装容量的限制,且表达产物的结构更为简单。本研究通过构建含有BDDhFⅧ的真核表达质粒,转染HepG2细胞使其稳定表达人凝血因子Ⅷ。方法：参照GenBank人凝血因子Ⅷ基因序列设计引物并加入限制性内切酶位点及6个组氨酸。PCR扩增产物和pcDNA4/v5-his空载体分别经Nhe Ⅰ和XhoⅠ双酶切,0.7%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收后将BDDhFⅧ基因片段插入pcDNA4/v5-his空载体中构建pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ重组真核表达质粒,测序正确后电转入HepG2细胞。同时pcDNA4/v5-his空载体电转入HepG2细胞作为对照组。HepG2细胞经300μg/ml Zeocin筛选构建稳定细胞株,并分别收集24h,48h,96h及144h HepG2细胞培养液Ni-NTA纯化,利用Western blot检测凝血因子Ⅷ在HepG2细胞中的表达。结果：经限制性酶切和测序鉴定,成功构建了pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ重组真核表达质粒。在电击转染HepG2细胞后,通过Western blot检测证实,成功在HepG2细胞表达约160KD的重组人凝血因子Ⅷ。分别在24h,48h,96h及144h,收集pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ转染HepG2细胞构建的稳定细胞系培养液,经Western blot检测可见,96h时细胞培养液中重组蛋白分泌最多,而144h时重组蛋白出现部分降解。故收集96h pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ转染组及空载体pcDNA4/v5-his转染组HepG2细胞培养液进行Ni-NTA纯化,纯化样本变性后Western blot检测经光密度比对可见pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ转染组细胞培养液Ni-NTA纯化后条带明显比未纯化的HepG2细胞培养液的条带密度高。且洗脱液2(Elution2)是光密度值最高的,而空载体pcDNA4/v5-his转染组未见条带。结论：本实验选择载体pcDNA4/v5-his构建含有BDDhFⅧ的重组真核表达质粒pcDNA4/v5-his-BDDhFⅧ,利用电转染法转入HepG2细胞,获得表达人凝血因子Ⅷ的稳定细胞株,并通过纯化得到大量的重组蛋白,这为进一步研究凝血因子Ⅷ奠定了实验基础。
