棉花是世界上重要的纤维作物,棉花纤维是棉花的主要产品,由棉花胚珠外珠被表皮细胞经极性伸长而成。其发育过程分为四个既明显区分又有所重叠的时期:纤维细胞的分化和起始期、纤维细胞的伸长期、纤维细胞次生壁沉积期和脱水成熟期。经过这四个发育时期,陆地棉成熟纤维细胞一般长达20-30 mm,厚度最终可达15μm。纤维细胞不仅有着极度伸长的细胞形态,而且具有特殊的细胞壁组成,细胞壁中纤维素的含量可达95%左右。这些特点使得纤维细胞成为研究植物细胞伸长,纤维素合成和细胞壁沉积的理想材料。但迄今为止,纤维细胞生长发育的分子机理还知之甚少。植物甾醇是植物中一大类重要的化合物,它不仅是植物激素油菜素内酯(Brassinolide,BL)的生物合成前体,而且是植物细胞膜的重要组成成分,近年来,对拟南芥植物甾醇生物合成缺失突变体的研究证明,植物甾醇在植物的生长发育过程中具有不依赖BL的独立作用,其对细胞伸长、纤维素合成和细胞壁形成过程具有重要的影响。植物甾醇合成途径由甾醇C24-甲基转移酶(SMT2,C-24Methyltransferase)在24-Methylenelophenol(甾醇4-甲基-24-亚甲基胆甾-7-烯醇)处催化其甲基化而分成两条途径,一类产物为C24-乙基-甾醇,主要产物为谷甾醇;一类产物为C24-甲基-甾醇,主要产物为菜油甾醇。谷甾醇和菜油甾醇是植物中两种主要的甾醇,占植物甾醇总量的90%左右。这两种甾醇对植物发育的影响基本代表了植物甾醇对植物发育的作用。为了研究谷甾醇和菜油甾醇对棉花纤维生长发育的影响,本论文主要从三个方面对其进行了探索。首先检测了纤维细胞生长发育不同时期谷甾醇和菜油甾醇的含量及比例,分析了两种甾醇的含量变化与纤维生长发育阶段的对应关系;进而在生理生化水平用甾醇合成抑制剂处理离体培养的棉花纤维和室外生长的棉花纤维,扰乱纤维中植物甾醇的合成,从反面证明甾醇对纤维生长的影响;最后通过基因工程途径,改变影响谷甾醇合成的关键酶基因GhSMT2的表达水平,从而改变纤维内源谷甾醇的含量以及与菜油甾醇的比例,在遗传学水平明确谷甾醇和菜油甾醇对棉花纤维生长发育的影响。实验的主要结果如下:一、谷甾醇和菜油甾醇在棉花纤维快速伸长期的含量最高由于在纤维生长早期,难以从胚珠表面分析纤维,因此从开花后第6天开始分别检测纤维和胚珠的甾醇含量。运用GC-MS检测了纤维和胚珠在此后各个不同发育时期菜油甾醇和谷甾醇的含量。结果显示菜油甾醇和谷甾醇的含量从6DPA开始上升,在8DPA时达到最高值(谷甾醇0.435±0.081mg/g,菜油甾醇0.086±0.016mg/g),其后有所下降。但整个纤维快速伸长期两种甾醇都保持在一个相对较高的水平。在15DPA时,谷甾醇的含量下降到0.306±0.036mg/g,菜油甾醇含量下降到0.062±0.090mg/g。这些结果显示在纤维快速伸长期谷甾醇和菜油甾醇具有较高的含量水平,其变化模式是随着纤维伸长速率的增加而升高,随着纤维伸长速率的降低而下降。由此说明谷甾醇和菜油甾醇在纤维伸长过程中具有重要功能。在纤维次生壁合成起始期和次生壁合成期,菜油甾醇和谷甾醇的含量较低,且变化不大。进一步说明两种甾醇与纤维的伸长关系密切。二、植物甾醇合成抑制剂能够抑制棉花纤维的伸长为了进一步证明植物甾醇在棉纤维发育中的作用,用植物甾醇合成抑制剂处理离体培养的棉花胚珠和植株上的棉花花蕾,观察扰乱植物甾醇合成对棉纤维发育的影响。结果表明抑制剂可以抑制纤维的伸长,在加入了抑制剂的BT培养基中生长的纤维长度比对照纤维长度要短6.04mm到9.51mm。同时生长在高浓度抑制剂培养基中的胚珠的生长也受到了抑制,胚珠的长度和直径都比野生型的要小。用抑制剂十三吗啉处理植株上的棉花花蕾使棉花纤维的起始受到抑制,被处理的胚珠在开花当天其纤维突起比野生型小;被处理的成熟纤维的长度为27.17±1.56mm,而对照的长度为30.00±1.64mm,处理过的纤维长度缩短了9.4%。这些结果进一步表明植物甾醇对纤维的伸长具有重要作用。三、改变内源谷甾醇和菜油甾醇的含量将影响纤维发育为了在遗传学水平进一步明确菜油甾醇和谷甾醇对纤维发育的影响,本实验利用基因工程,改变控制谷甾醇合成的关键酶基因GhSMT2的表达,进而改变内源谷甾醇的含量以及其与菜油甾醇的比例。以植物组成性启动子控制GhSMT2基因在转基因棉花中超量表达。实验结果表明超量表达GhSMT2基因的转基因棉花中谷甾醇的含量有所上升,菜油甾醇的含量有所下降,菜油甾醇和谷甾醇的比值下降明显,仅为对照植株的1/6。与此相对应,转基因纤维的伸长受到一定程度的抑制。胚珠培养10天的对照纤维长度为11.84±1.30mm,且胚珠表面纤维较多。而培养10天的转基因纤维长度为4.29±1.25mm,仅为对照长度的36%。转基因成熟纤维的长度比对照短,而且转基因的棉桃较小,种子败育较多。同时超量表达甾醇合成酶GhSMT2基因也将增加纤维细胞壁的充实度。
