EB病毒潜伏膜蛋白2A多表位重组基因在大肠杆菌中的表达、纯化、单克隆抗体的制备及其在血清学检测中的应用

Epstein-Barr病毒(EBV)属γ疱疹病毒亚科，在世界各地广泛传播，为95％成人所携带。EBV原发感染通常引起传染性单核细胞增多症(IM)，一旦感染将终身携带。EBV能感染人体内的静止性B淋巴细胞，部分感染细胞能转化为淋巴母细胞(LCL)建立潜伏感染。EBV携带者体内存在着较强的特异性CTL，控制着EBV的潜伏感染，但不能清除病毒。宿主免疫功能低下时，感染的B细胞无限制增殖而发生转化。目前已证实EBV与Burkitt’s淋巴瘤(BL)、霍奇金氏淋巴瘤(HD)和鼻咽癌(NPC)等的发生密切相关。鼻咽癌属于EB病毒引起的一种最常见的非淋巴细胞恶性肿瘤，全世界NPC病例80％发生于我国。鉴于鼻咽癌不能手术治疗，而放疗化疗也不能有效清除肿瘤细胞，绝大多数病人易发生远距离转移，因此早期诊断和免疫治疗显得十分重要。EB病毒与NPC的发生密切相关，通过检测EBV的抗体早期诊断NPC是提高NPC患者存活率的一个重要的手段。随着对EBV的血清流行病学的研究和分子生物学的发展，克隆、表达、纯化EBV的蛋白或多肽，并以此为抗原建立简便、快速、灵敏和特异的检测EBV抗体的方法是目前研究NPC诊断的主要发展方向。EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)能稳定表达于一些EBV相关肿瘤的细胞膜上，与病毒的潜伏感染和细胞转化密切相关，并参与调节跨膜信号的转导，其功能日益受到重视。本研究用重叠PCR方法得到包含LMP2A四个主要抗原表位的基因序列，该重组基因命名为EC2A，构建原核表达质粒pET32a-EC2A，转化大肠杆菌进行表达并纯化；以纯化的融合蛋白为抗原免疫小鼠制备单克隆抗体并鉴定；初步应用纯化的蛋白来进行EB病毒相关鼻咽癌病人的血清学检测。主要研究内容和结果如下：一、EB病毒LMP2A多表位重组基因在大肠杆菌中的表达及纯化运用软件对LMP2A编码基因序列进行分析，并预测其可能的抗原表位。经重叠PCR得到包含LMP2A四个主要抗原表位的基因序列，重组基因命名为EC2A。构建重组原核表达质粒pET32a-EC2A。重组质粒经PCR、酶切鉴定、核酸序列测定和分析后转化大肠杆菌(Ecoli)BL21，经诱导表达的融合蛋白用镍柱亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western blot结果显示表达的蛋白分子量约为40kD。二、EB病毒LMP2A多表位融合蛋白单克隆抗体的制备与鉴定以纯化的融合蛋白为抗原免疫小鼠，按常规方法融合，经反复克隆及亚克隆后得到一株能稳定分泌鼠抗人LMP2A单克隆抗体，命名为1F5。采用腹水诱生的方法进行单克隆抗体的生产，抗体腹水经饱和硫酸铵沉淀法初步纯化后浓度为10mg／ml。经快速定性试纸法鉴定1F5的重链为IgG1，轻链为κ。ELISA法分析表明，纯化后单抗的效价为1：10000以上。Western blot分析结果显示这株单抗具有良好的识别LMP2A分子的特异性。三、EB病毒LMP2A多表位融合蛋白在鼻咽癌血清学检测中的应用以纯化的蛋白作为抗原，用ELISA法检测EB病毒相关鼻咽癌病人的血清中的抗体，结果显示检出率为84.4％。此方法与常规VCA／IgA法比较，敏感性略高。此方法有望为临床NPC早期诊断增添一种方法。综上所述，本研究成功克隆了包含LMP2A四个主要抗原表位的基因序列EC2A并在大肠杆菌中表达，用纯化的融合蛋白制备了一株单克隆抗体，并将此蛋白初步运用于NPC病人的血清学检测，显示其能检测到特异性的抗体。本实验为今后研究LMP2A的生物学活性奠定了基础，以此为抗原也有望应用于临床检测。